明胶铺板处理的机理

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明胶知识问答：
$ K8 B! m% x+ i7 c) _一、明胶铺被
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" w( C* Y7 Q6 i1 H1、问；我曾经常识过高压与过滤两种方法。其中高压之后的明胶，即使放4℃冰箱仍很澄清，这是不是明胶变性？你觉得高压可靠吗？明胶里是蛋白与氨基酸能耐住这么高的温度吗？另外，明胶在37℃水浴溶解澄清后，过滤仍不易通过（每50ml大约可滤到30ml），而且过滤后的明胶再放到4℃就又变为胶冻状，经37℃水浴澄清后铺瓶。这样反复三次，发现我的明胶有些浑浊，不知什么原因，是不是这样的反复水浴对明胶十分的不利？
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+ f# B% @& S3 H4 H% X& a答：不用过滤，高压就可以了，可靠，我都用了好几年了，而且，我这个方法教给很多很多很多人了。
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& |! a* o6 A* z$ @$ G3 c6 C2、"0.5-2%明胶PBS",到底是该怎样做,能详细些吗?6孔板每孔要用多少明胶呢?不同规格的培养瓶加明胶的量是怎样算的呢?是将底部铺满为准吗?
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问：我正在养，前一段时间养了牛的，结果第二次就长细胞了，但是第二次的在第二天就发现像是染菌了，因为没舍的倒掉，换液后又放了三天，结果看见有多角形细胞生长，而且有成片生长的，当时长势还不错，但是培养瓶内漂了大片物质，当时还以为是组织碎块，但是这些东西长势飞快，换液后第二天就有很多，类似树根状的。为了防止在孵箱内感染别的细胞就倒掉了。紧接着又做了两次牛的都没有细胞生长。由于牛头难消毒，而且不方便一人操作。我又尝试养大鼠的，取新生两周后的大鼠4只，结果匀浆后，再过100目和200目网时发现200目网上没东西，请问是因为大鼠太少？还是匀浆太细了？我开始是用的布式漏斗加尼龙网过滤，但尼龙网高压后易变形，我就借来别人的不锈钢网类似勺状（底是平的），网会有影响吗？请问你养时，取200目网上的东西后能见到微血管段吗？微血管段消化离心后有含血清的培养基悬浮铺瓶后能见到细胞吗？再是您的细胞传代时是不是也要用明胶铺被培养瓶？答：大鼠太小了吧，取70-100g的大鼠吧，新手的话，5只大鼠做一瓶吧。尼龙网没有关系的，可以看到微血管段。见不到细胞的，都是慢慢从微血管段中爬出来的。高兴的时候都铺。(养细胞还是一件比较高兴的事情吧)6 Z# b. l5 N2 c# r$ U
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实验步骤：
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4 |( V% V4 P8 F& Z. D: R* e9 y% v无菌条件下取新生小牛大脑皮层灰质部，4℃ D-Hank′s液洗涤4次，至无血迹残留。剪成1mm3左右的组织碎块并置于玻璃匀浆器内，加入两倍体积的MEM培养基，匀浆上下20次？, E' l  V/ ?% |' v
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匀浆液先用100目（直径149μm）尼龙网布式漏斗抽滤，培养基洗涤4次，收集滤液。然后用200目（直径74μm）尼龙网布式漏斗抽滤，MEM培养基洗涤4次。细胞刮刀收集200目尼龙网上的组织（即牛脑微血管），将其置于离心管中，1500r/min离心洗涤10min。离心洗涤的脑微血管悬浮于的0.1%胶原酶中，旋涡振荡15sec以充分混匀，置于37℃恒温振荡水浴箱中振荡消化50min？6 @) C, o/ P% L; k. W/ y+ f

, j$ \# `6 H. ?" Y! q取出后旋涡振荡15sec，1500r/min离心10min，弃上清，用20%BCS的培养基悬浮，接种于明胶铺被的培养瓶中（培养瓶中加入1%明胶 - D-Hank′s液洗涤3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明胶溶液即得明胶覆盖的培养瓶），置于细胞培养箱中，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。静置5～7天后，可见少量细胞生长，20%BCS的MEM培养液换液，以后每2～3天换液一次，至细胞长成致密单层后可传代培养。3 I2 K2 W+ v* w! ^" }6 k

9 a+ A6 ^9 Z4 I您能帮我看看这些步骤哪儿有问题吗？（如果换成大鼠的话）5 _! |2 n+ T2 r2 Y

! n* v8 L) |. Z! y% S! U. Q! S  h, v; Y再是关于打的地方，我想到的是匀浆是不是不能太细得到什么程度？如果细胞都是慢慢从微血管段中爬出来的，那是不是胶原酶没必要消化那么长时间？反而把微血管段的细胞都消化死了呀？" y( A* c% ~  Q3 c

0 O; f0 S1 p" [/ ^2 t0 Y答：血清浓度25%，生长因子要用够量。
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; C- U) M5 n3 _* N% O: h二、明胶过滤
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配制0.5％的明胶PBS，先水浴（多少度）使之溶解（多常时间？），然后高压灭菌，为何其内仍有许多沉淀？振荡瓶子以后，就会漩涡样从瓶底浮起，似为未溶解之明胶。我又用针头式小滤器过滤了一遍，液体清澈了许多，但其内仍有碎屑样物。1 ^) @8 D' m% b7 P7 M: t

* x1 ]/ `$ n) b/ I1 x9 Q答：我想是水浴溶解不充分吧，应该没问题。明胶溶液没什么颜色，水浴时有不溶的也不易发现。建议买ＳＩＧＭＡ的，一分价一分货。我用纱布过滤的，用时水浴。
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8 h  h- K9 g8 b  {三、明胶溶解) \1 f$ |0 U' v! Q. s

) m1 S0 Q" k  a! [明胶溶解，可以用微波炉加热的，很快，而且也没有什么影响！可以高压 ；确定你需要的明胶溶液的浓度，称取一定量的明胶粉，加到有盖的容器中，加入一定量的dH2O或PBS，摇匀。不必等明胶溶解，可直接高压。装有明胶的瓶口稍微旋松，放入高压消毒锅，15psi，20min，就ok了。高压结束后，盖紧盖，摇匀即可。用0.1M的氢氧化钠溶液调整PH到7.0左右，明胶可迅速溶解。6 I& l' |! T) z1 \4 i

% g& \) k5 ]$ U& r! ^7 s- i可以有三种方法溶解：* P9 r( C( L$ d2 g: q. R
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1、将明胶倒入冷水中，经10分钟浸泡，用热水浴法加热搅拌溶解（注意温度不要超过70℃）。
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1 D/ w+ l& w9 p% y: U/ l2、将明胶到入冷水中，10分钟后用小火加热（注意温度不要超过70℃），并不断搅拌直到完全溶解。" l0 ^# y$ S6 h1 D
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3、温水（40-50）倒入明胶后不断搅拌直到完全溶解。此法小量适宜。1 S2 k. l0 ?, ^* Q  }8 b% k9 t8 K

3 d% H2 @8 \1 @5 I" U四、明胶保存
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7 W& t+ Q- I) y3 y溶解好的明胶如何保存？我配的是1%，按文献放在4度冰箱后凝固成果冻状了，怎莫办呢？答：溶解好的已灭菌的明胶一般放4度保存。我以前配制0.1％明胶，4度保存，没有出现你所述情况。不过在使用时，仍然需要室温放置一段时间后才使用。我想你遇到的可能是浓度大了出现的情况，当然更需要预热，摇匀以后再使用。
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五、明胶包被- z' x7 {0 Q5 q

4 [: b6 O7 \$ @9 }( w7 I1%的明胶，但是包被的时候明胶不变成固体的呀？出什么毛病了呢？明胶在室温的时候是液态的，那么它在37度CO2碳培养箱的时不变成液态吗？明胶37度时确实是液态的. 我用明胶包被培养板或培养瓶24小时后, 将明胶倒掉,用培养基冲洗,就可以接种细胞了.
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) i, l4 T6 p& Q$ s有人说,铺好的板子在显微镜下可以看到明胶的结晶但是为什么我的什么都看不到呢?答：明胶铺板时间一般在0。5-1小时左右，根本在显微镜下看不到有什么结晶，你这听谁说的？$ j; p, [6 y* n& H9 ~, l6 ~$ r
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明胶可用高压干热灭菌（此法若是明胶含水量不够低会造成明胶的溶胀性明显下降）或微波炉8秒钟杀菌（可多次）；而明胶溶液可用微波炉8秒钟杀菌或更短时间多次灭菌，原因是明胶溶液只能在50摄氏度下保持性状，在50度以上后会逐渐变性，失去明胶原有性状。如果1%明胶配好后不易采用滤过方式灭菌就可采用微波炉8秒钟杀菌法。8 _; ~* x2 E- e1 A

4 J- x8 Y, G9 b1 ^9 a: S把明胶加入PBS，配成0.1%的明胶PBS。然后装入可高压灭菌的玻璃瓶中高压灭菌30分钟。然后在24孔板中加入配好灭菌的0.1%明胶PBS（可盖住24孔板即可），4度放置3小时（或过夜），铺细胞时把明胶PBS吸出来，然后把细胞铺进去就行了。加明胶的目的是帮助细胞贴壁。有的细胞不用加明胶也可以。
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我看到有的书上用1.5％的明胶，那样是不是很粘，不好吸出来啊？另外，明胶不是多肽蛋白类的吗，能高压灭菌吗，我有点不明白了
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/ v3 ]# @( }  V/ g( Q我的方法和楼上的不一样，因为我订的明胶上写明要求2-8度保存，这样的明胶能高压灭菌吗？会不会变性啊？也许楼上用的和我的不一样1 _! S& m4 ~, r
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我用的 是sigma 20ml 的液体的2%明胶，使用很方便。
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2 z! a" }& p5 _7 S1 mG1393 20ml Lot:44K23881 RMB:大概三百多块钱。
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9 M9 {2 `- c; B6 T* _  @使用方法：
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1、产品为细胞培养级，因此无需灭菌，贮存于4度冰箱,最好分装保存。6 Q7 U' M6 X! R% r

1 u" n* v# D/ h: ~+ W2 L2、使用时根据需要取若干ml,我一般取2ml，无菌条件下用去离子水或PBS（我习惯用水）稀释成0.1%的工作液，同样贮存于4度。# g) _+ H- i! t3 Z2 B
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3、包被时用吸管吸取少许，涂步24孔，原则上，只要孔的所有部位都被明胶浸湿过就可以。例如，你可以吸取0.5ml左右明胶加到一个孔中，吹吸液体，使液体完全接触孔的所有 部位，然后将培养板倾斜，将明胶全部吸出,再同法依次包被其他孔。包被后于超净台上放置30-40min ,使用前打开盖，在超净台上吹干（此步也可省略，但是我为了能看到包被效果，都花几分钟吹一下），包被效果可以在显微镜下直接观看，包被好的话可以看到整齐排列的结晶。并不是明胶越多越好，只要挂上一薄层就行，因此尽量把孔中的明胶吸净4。用过的 明胶可以回收，但是包被效果稍差。我一般都扔掉，因为20ml2%的明胶足够用了 。
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我看到的细胞培养的一般都是0.1％的明胶，有的用0.2％，但是没见过1.5％，你再确定一下，这样浓度的明胶如果包被板子也可以，只不过太浪费了吧，没有必要。而且包被完之后明胶实际上是在板底形成一层很厚的模，如果细胞消化传代的话，培养液里就会出现悬浮的透明的薄膜，感觉很脏。; A8 ?3 k# C" ^

6 D0 F0 n! o) Y7 d1.5％当然很粘，我用的2％的明胶液体在室温下成半固体状态，吸的时候也不太好吸。不过只要的动作慢一点，应该没问多谢你的指教。我还想问，明胶消毒之后可以放置多长时间？还是现配现用呢？你说的分装是指直接铺在培养瓶吗？如果不是的话，放在4度冰箱不是已经固定了吗？固定之后有怎么铺在培养瓶呢？因为是没做过实验所以很不明白。请多指教。
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sigma 有现成的终浓度是2%的明胶，已消毒，买来即可使用，方便而且不贵，仅100多块钱。4度时明胶是胶冻状，室温下放置20-30分钟就可变成液态，说明书上建议使用的包被密度是5-10ug/cm2。国产明胶就可以的，用去离子水配成1%即可。可以一次配50ml或100ml。使用时取你所需量高压灭菌即可。灭菌结束取出稍凉就可以铺在培养瓶 3 |# q! `+ {: p0 i2 d, S) I! r# d
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如果加入明胶的目的就是为了让细胞贴壁生长的话，完全没有必要花费这些多时间和费用来做，到市场到买回来几块TC处理过的细胞培养板就可以了！COSMO品牌现在已在北京合资了，价格下降很多！现在特价一块只要8.00元$ D0 R, z7 T+ e4 Y
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明胶溶液可配成2％浓度，加热至40－50℃，过滤除菌。包被培养瓶时4℃过夜即可。我们用Sigma的明胶，感觉很好，也不贵！！我们把2％的明胶用去离子谁稀释到1％，并通过0.22um的滤器过滤用于细胞培养！
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5 e* p* u0 j7 ~' Z$ x+ p7 ^我们包被培养瓶是在细胞培养箱中孵育至少1hr，我们做的很好，你可以试一试！！养内皮细胞，0.1%的明胶如何配？如何消毒？怎样铺？急0.1％明胶：称取明胶，用三蒸水配成0.2％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，过滤，放4℃备用。(即用过滤法消毒)附文章:人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验 撰稿　刘　金. f' P! f  f* v. p0 b+ w+ ^

) ?+ c% H+ j, k一般用0.1%明胶包被30min以上即可以使用，一般根据细胞瓶的大小加入适量的明胶，然后放置于37度培养箱中30min以上即可使用，使用之前将多余明胶弃去忘了说一句，用前要放在显微镜下观察一下，看看有无颗粒及异常物质, K' B2 @9 r' K/ A! o/ X& ~
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该法是用于一次性培养瓶的重复利用呢，还是对于玻璃瓶的处理呢？0 |+ G7 q4 e8 {8 M
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请问各位师兄师姐，培养瓶包被明胶浓度一般是多少？包被后需要干燥吗？干燥的过程中容易污染吗？包被后是放在4度冰箱中过夜还是放在培养箱中过夜？明胶的分子量大，且在摄氏37度以下发生凝胶化，当然过滤不动了。应该高压灭菌。我用明胶包被的培养瓶，用的时候发现里面有好多小点点，有的亮有的黑。我不知是污染，还是明胶的颗粒？你们有没遇见这情况？ 0 G% O! x! E" ^+ e+ v5 E+ C) }4 W

1 b% n: ^1 ?4 s1 Y2 T7 A4 I* u明胶溶液配好了以后，不能高压！因为高压后，明胶变性。可以配成0.1%-0.2%,溶解后0.22um滤膜抽滤。不过要多准备几个滤器，因为比较难抽。使用时，加上明胶，覆盖培养平面即可。置于培养室中1-24h，取出，弃去液体，用培养基洗一遍即可。; U  h! t- P" \0 V3 C- ~6 [
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明胶溶液可以高压(不怕变性，有可溶的和不可溶的，可用sigma的，不贵。另外，二者均可高压后使用，我都试过)，用PBS配。浓度在0.5-2%均可。将3-5ml明胶PBS放在培养瓶中，培养箱中包被1h以上，能过夜是最好的。用前取出，吸弃明胶，加入1-2ml培养液(10%血清即可)冲洗，稍微吹干即可使用，培养效果甚佳。
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) _! e3 ?; ]) N( `2 P+ O抱歉，这是我师兄做了3年实验和我养3年细胞的经验，书上并无详细说明。具体原理可以参考《细胞实验指南》(冷泉港实验室)，明胶的主要成分是I型胶原，铺胶包被后，可以促进细胞增殖、迁移，而且价格便宜，因而用于包被很是适宜。理论上说，用水配也没有什么大不了的，但是最后一定要用培养液洗一下(有的文献认为血清中的蛋白可以中和一下的)。我习惯用PBS配，实验条件固定了，就没有去改过了。包被的培养瓶不需要干燥那么久，如果是塑料培养瓶只需稍微干燥(通常我就在超净台中，吹5－10分钟而已)，玻璃类的30min就可以了，其实个人认为，干燥并非非常重要，而主要在于包被，务必放在温箱中。另外，还取决于细胞种类，我以前养的是内皮，娇气一些。如果是肿瘤细胞养在玻璃片上，都不需要吹干，包被后洗完就用即可使用。我觉得我回答得很清楚了，就不给你发邮件了如果这样，
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; r* \  `7 W2 U# T那你就包被过夜，吹干半小时到一小时吧，瓶子用塑料瓶。原代接种后，让细胞多贴几天(3天)，绝对静止不动，血清给点好的胎牛，相信一定能贴得很牢固的。另外，你制备原代细胞时，尽量不要对细胞损伤太厉害，比如挑个好点的离心机，离心转速不要太高，适当可以采用低温或者4度，尽快接种到培养瓶中等等。祝你成功！
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接种细胞前是否要用培养基预培养一下包被的培养瓶？我是这样做的:200mg明胶溶于100mlPBS中即成0.2%明胶溶液,60度水浴过夜,次日过滤,4度放置不会发生析出,可用于包被培养瓶.细胞贴壁很好.建议楼主也试用一下.  
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; j7 X5 F1 b0 }5 Q3 U. O1 t问： 明胶的作用是起到使细胞更易贴壁的作用吗？% y8 o6 t: w% K6 V  B+ \7 ]* I( W
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答：也可以这样说，明胶可以支持ESC成克隆性生长。& K( g8 n# N2 o6 O! c
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问： 铺了后，能用什么方法检测的确是铺了呢?
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. H" m1 |. e- l( U( k答：不需要做任何检测，残留在瓶壁上的明胶就已经足够了。可以用PBS冲洗一遍后，再用含血清(10%)的培养液1ml冲洗一遍。
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你说那些颗粒是明胶颗粒，没有关系的。最好还是按上述步骤冲洗一下。粗制的明胶中会混杂有不少细微的杂质，我认为你在显微镜下所观察到的颗粒也有可能就是这些物质。我们实验室在高压消毒前通常会将配好的明胶溶液先行滤过一下。并且，明胶铺板后室温放置30分钟后即可将多余的吸弃，不必放入培养箱里过夜。明胶在室温下的确难溶，可以将其置于50-60度水浴中助溶，随后立即正压过滤。明胶包被好后如果不马上使用,可以盖紧瓶口放入无菌饭盒内4度冰箱短期存放，用时PBS冲洗一下。还有，如果zbch 是在培养ESc，我建议你将明胶浓度该为２％。０．１％的明胶由于浓度低，对克隆的支持力较差，不能形成较大的克隆，并且ESc也容易发生分化。 ! h- E. b' d0 z) t* Z
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用0.5M的乙酸配制成1mg/ml的储存液保存于-20度，用时用双蒸水或PBS6 W+ z# l) [$ L- i6 t; ~

# P4 n2 y0 ~+ _2 g" M: f$ @稀释成0.1mg/ml，0.5-1ml 可涂布10个35mm培养皿。3 j3 k9 U6 h' G# w9 S
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1、配制方法：
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  G8 O3 w: [6 W/ A. K5 p（1）先配制0.5M乙酸（用双蒸水配制，如600mg冰醋酸可配制20ml），0.22um滤膜过滤除菌3 C) P: y) u( M4 \

( [% C9 ]- `/ P  K/ y9 Z（2）打开包装加入一定量的0.5M乙酸（如有5mg粉剂则加入5ml），封好后置于4度约1-2h即可溶解
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（3）以100ul/管分装后保存于-20度, ?. y3 E7 k  q- j/ s- R" o0 R! C
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2、涂胶方法：
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（1）取出一管储存液，融化后稀释成0.1mg/ml，即为1ml
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# F6 K2 z2 _" a! t# d+ o( g（2）一个培养皿涂布均匀后吸出至下一个培养皿（可尽可能减少使用体积，涂布一薄层即可），涂布完毕后置于37度培养箱中约1-2h以晾干（可置于消毒的饭盒中稍敞开一点培养皿盖）7 F8 g3 ~& j# o( P8 ?  g6 ]

  z  D+ k; p/ b7 f) ?) G- W3 i& L0 w（3）接种前用PBS冲洗三遍
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5 E, l- I! w3 s; U当然具体的使用量可根据你的需要来定，并可事先分装保存好装过明胶的玻璃瓶如何清洗。本人养细胞用过的装明胶(1%gelatin)的玻璃瓶无论是用水冲,还用胰酶洗,又用开水煮30分,都冲洗不掉内壁上面的明胶,请教一下各位学长,非常感谢!!
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泡酸清洗即可。注意酸液残留，多用自来水、超纯水冲几遍8 U4 ]0 E: G+ a; N3 [

% |- a" U" Q  i0 }9 C4 O明胶和胶原，都带正电荷，辅助细胞贴壁。胶原更好！
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鼠尾胶原（collegen）：常用的包被培养皿的基质。! D* |- y: R# ]2 \
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1、75％酒精浸泡大鼠尾巴30min； & J0 y2 R( T' }6 w) O- d! j9 {
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2、将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段，抽出银色的尾键；
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3、把剪碎的尾键置于150ml，0.1％消过毒的醋酸中，4℃放置，并不时振荡； 9 k- j+ d9 U4 j1 O1 |6 `: G
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4、48h后取上清，4000转离心30min后，取上清；
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分装上清（鼠尾胶）4度保存。
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/ w# Q; e0 x1 {) \2 ?8 u, Z有时可继续向4。中沉淀中加入10－20ml醋酸，重复以上步骤，以制备更多的鼠尾胶。
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; `  _/ _: ^3 |4 ~6 ]6 _: y( r# o0.1%的醋酸（冰醋酸）应是g/L,和0.9%盐水所指的一样，查过冰醋酸的密度是1.04,分析纯的冰醋酸的浓度应大于99.5%,因此配制时基本可以用1ml溶于1L双蒸水中得到0.1%的醋酸。置于盐水瓶中10磅10～15分钟即可，消毒时（包括其它液体消毒），觉得在瓶口与胶塞中放一根棉绳，消毒完后（必须基本冷却后再打开压力锅，否则胶塞会炸出）扯出棉绳，这种方法最好
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由于胶原液不能过滤也不能高压灭菌，所心制取胶原过程当中注意无菌操作，在使用时待凝胶后。放在紫外线下照射过夜，第二天便可使用。9 G4 }3 v! Y, F: }0 F1 J

7 `1 P* C8 E4 X; n  k9 F% n8 S在园里搜索了一下关于明胶在细胞培养中的使用问题,还是有很多问题大家没有详细和标准的说明,现在有几个具体问题,请教各位战友,
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1、明胶溶液配置的问题:用无菌PBS配还是用去离子水配?我们实验室有国产的明胶,很大一瓶的那种,能不能用于细胞培养?难道一定要用GIBCO 20ML即用型的?
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( M4 F4 w) h" `9 r2、明胶使用浓度的问题:有说0.1%,1%和2%的,我养的是内皮细胞,应该用哪种浓度呢?
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3、明胶消毒的问题:有人说可以高温高压灭菌,有人说应该要过滤...还有人说要先高压再乘热过滤?不会吧,到底要怎样?晕啊~~~ 2 i4 @3 e7 L2 ~- R& i

3 ]9 v# X; y2 F% J/ X% c4、明胶包被培养瓶的问题:有人说包被后置培养箱过夜,用时在弃溶掉的,加PBS和培养液冲洗..也有人说包被后吹干30min-60min .再加培养液冲洗即可用,到底怎么个做法啊/ u2 X4 {! S  K" T4 a, b7 m

* ?1 T: o4 \2 o. Z7 F5、明胶包被后的培养瓶使用期的问题:包被后的培养瓶能够用多久呢?有文献说包被7天,干2-3天后放4度保存可以在两周内使用
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$ X1 t# k3 \- r% @以上是我的不解啊,望各位大侠指点!!! 1％明胶PBS高压消毒后置于4度冰箱，未见呈胶冻状，请问是否正常？谢谢本人是新手，最近要做胎鼠神经元培养，因为实验室有明胶没PLL，所以想问一下能不能代替，因为大多数文献上都是用PLL（多聚赖氨酸）。' L: A5 @' F+ o3 i8 O- s4 @

7 L. e8 r7 d* B% F1 S答： 可以的，都是为了帮助细胞贴壁。鼠尾胶用于细胞培养最好，也最常用。: |' X7 D8 r$ [, }8 ~6 y
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