关于Splinkerette PCR的一些疑惑

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LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

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附上文章

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呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

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8 O+ A  q$ z& Q5 J& l' P* @& V/ z) P
你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。
% m) K! \3 V# O1 X/ H+ Z- E3 N4 w
6 U# w# D. V+ w两个问题：8 H. c% F: E+ W$ h+ V1 e9 ^
1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，
% u) f1 ?: t7 T. b: w至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。
2 ^1 ]8 ?- }1 v, k7 T8 q3 c! }/ u( K2 C9 F
2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶! Z/ |+ V+ g0 G% a$ c' ]4 ~
附上一个图吧：) r$ m0 _1 B* g! b

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  H$ x6 k! Z5 q+ |0 A$ B( O+ D" @! p* V8 S
P.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

splinkerette

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9 ^2 [* a' Z  c: m0 I7 T4 v
5 Y. B" C/ _# p  F6 t平时合成的普通引物，两头都是OH，我估计文章中所提到的不磷酸化，应该也是指5‘端的。不过这些个问题操作起来都不需要考虑的，直接把序列发过去合成就可以了

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回复 jiabiaohu 的帖子/ ~5 P8 ?7 K: m5 g* t
2 Z* E0 Z, K6 I& O, ]
具体到结果上的差别我就也不清楚了，EcoRV 的酶切应该就是为了简化PCR的反应体系吧，或许能减少一些非特异性的反应。如果在你针对于“Transposable Elements”设计的下游引物之后有合适的酶切位点的话，我建议还是不妨一试。 不过至少我做的时候省略了那一步，也能出实验结果

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" C6 n, l! o3 E( `3 u$ |
' M% o6 H( u, q不好意思，我没有太看明白你的问题

splinkerette

回复 jiabiaohu 的帖子# r$ Q1 {# D9 D

- P1 U5 S% T1 N2 @$ W/ W5 Q对的，像我之前说的那样，类似于合成引物那样，直接送出去合成就OK了

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$ Z7 q$ P! d6 K3 w
. [1 a' N% E5 \$ p呵呵，不客气，祝你实验顺利