关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。6 n# T9 L5 s2 w: R8 d
+ F. I, k) v/ q$ B
我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：) ~7 l& W) z" m4 x0 O, Z

/ u3 m& H8 O3 o$ s0 p1. 全基因组DNA提取
9 b+ v4 }+ O' {! a1 v8 ?+ G  N3 R2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端
' }" Z4 M8 Q( g/ W( P' @3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接) I: O9 K  V' U* M
4. 1st-Round PCR0 q; z! p9 I% \
5. 2nd-Round PCR) `( ^; {" d7 A: Z% l5 R  x
6. Sequencing
% a6 ~4 ~  D# F$ C. ^' O: y- n
* E: D7 T2 A( ~# D+ d现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
% `8 u  m3 j% r6 E+ B7 l4 ~0 Y因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
' Y( W( |$ M# b# k- h8 o% W. k
& z. X) o$ |5 g6 m比较着急，希望高人指点。谢谢~
; h& p3 q! {: ?7 d  K
, u' k, ^0 H" `) f( A. |% S附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

splinkerette

LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

splinkerette

附上文章

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子' l: w; F$ V1 M4 v  L! @& b
6 D  \5 v! C4 ^) x
谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

splinkerette

呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

钻石星辰

( Z6 N. C& c$ W2 @5 K0 c! }
+ p, R- ^1 i" N  X- F/ ~6 E3 _7 Y回复 splinkerette 的帖子
6 p2 j: t  u' K, n3 `% t# z  c2 ]7 V) E2 q' ^: t
你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。
" Y, I3 a- Y. L. l% A
# e; }9 e. |( [% C不过，我还有两个小问题：+ R, Q: v8 V' ]: U  J4 a8 i/ X8 S

# P- T6 f8 J1 z+ s- F1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。
0 @) e7 U* D% x: [  r; g( j这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？  }" P: B, w2 _
4 h- j8 X1 ]/ P
（没有用过NEB的酶不好意思）3 R  p" a6 S/ b$ c2 J
, b7 Y1 @% E2 j3 w8 k( U3 h
2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？  Y7 F* J- x4 z& x7 ]

3 b* ^  O6 d/ A8 S9 Z% T

splinkerette

回复 钻石星辰 的帖子& j. {- b9 r% {+ F+ `4 p% @

3 n& g) S4 v9 E4 g4 C4 w你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。) i9 ^% ]" G$ ]) \' D
+ N; p0 P; b2 w& y6 q9 n
两个问题：
6 I$ {. D' W1 b/ s* S2 [1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，
, Y: z/ n+ X! ?" g至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。* n1 ^1 L; c( B( g0 o
4 B! q, l# T2 v5 B( J
2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶
9 J3 }& r; ~" K/ S) @8 v0 H附上一个图吧：
! ~# [$ t% }) L( D+ G2 d

splinkerette

回复 钻石星辰 的帖子1 {( i2 |$ ?3 I# ^+ r  y

, f6 I/ ]+ t/ Y- d6 J7 T" DP.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

钻石星辰

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8 c# T. r- I# @3 z
6 H$ {$ ^% R+ X9 {' }7 b& Y谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

jiabiaohu

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8 q3 {" W/ d& e- @* W* |" q( I+ i6 E" ]
测序单上一般有PCR引物测序的，一般有两个选项，PCR纯化产物（即你跑电泳后割胶得到的），另外还有一个PCR未纯化，这个你也可以直接送过去，当你注明之后，测序公司会给你纯化的，当然测序费用可能要高些~~~