关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。/ K  i9 [: M! P0 T
0 t& w0 w5 }% ~
我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：
" Z) C, C# v$ _2 q" [/ T0 b' t. C' v1 V
1. 全基因组DNA提取4 I- n; L4 m, Y+ N* g
2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端5 k# Z) M# f) X: U" F6 n9 M
3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接9 x1 R. T' w6 \4 Z" p( a
4. 1st-Round PCR4 D! Y4 ~, c: j& h
5. 2nd-Round PCR
3 r6 U) F; J6 K8 I; l7 l9 V0 e9 _' t6. Sequencing4 D7 ~! r$ E7 k6 m9 V/ P2 x
% ^: [" j% X+ s/ @7 B
现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？. \! {3 t( c# n! E7 J5 Z  ]
因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
- @" I4 f+ f& b! ?
0 h9 \' ?* g/ V  [8 [' P" x比较着急，希望高人指点。谢谢~; o6 F$ t$ J- g5 C* A
! L& I3 E8 @0 x
附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

zerlardex

学习了

langziforever

回复 splinkerette 的帖子+ r% v, v  e; d7 P: j
, X/ I% d* @0 r( M$ S) L! n$ a
切胶主要是为了让测序结果更好一些，因为在一个等级的片段在上机测序时可以更好地控制时间，因为目前高通量测序都是要做类似于PCR的过程，这个过程就像PCR一样，不同的片段长度需要不同的时间，这就是为什么要切胶的原因，同时，你切的不同长度范围的胶也会让最后测序结果实际长度有个评价的依据，比如，50-100bp范围如果测出500bp的带，那么结果肯定是不可靠的，可能是污染。这也是为什么用4%的胶来分离酶切产物的原因，可以让条带分的更好更细！利于切胶。我觉得测序这块你懂这些应该就可以了，剩下就给公司做吧！只是你需要注意切胶和电泳时尽量小心，避免污染，因为高通量测序是很怕污染的！

langziforever

回复 钻石星辰 的帖子! H. }- P4 y4 |6 t2 T

7 f# ?/ E. T; f0 H/ l3 |1 L% UPAGE胶纯化的效果要比HPLC的效果好呢！所以，肯定是没有问题的！

寒窗飞雪

我对高通量测序比较感兴趣

寒窗飞雪

高通量测序的研究多不多呢

liulilin

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, ]" b2 j2 M3 F& c. K( Z2 z+ `+ e
/ \: ^6 f, S2 w) n现在我正在做转基因整合位点的鉴定，做三个月了 还是没有什么好的结果。痛苦ing

guotao

可不可以用于转基因整合位点的检测呢？

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子+ {  U' y1 n& S; D! B- a. E

6 J& ]* T( ^+ o. I/ f你好，请问我合成的splinkerette adaptor 没有按照Nature Method上要求的HPLC纯化，而是用PAGE纯化，对后续实验有影响吗？$ q2 u, n# n8 H1 x& T( ^+ B. D+ `

% Y% D9 Y1 l9 D7 B  \. x' n这两种纯化方式有什么不同呢？

splinkerette

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3 ~' ]# d8 ~2 V: V  }- r$ [( C
, M4 E6 d/ x" I0 {呵呵，不客气，祝你实验顺利