关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。& T. k8 n* r! e3 t  ^7 o) O7 Z

. V- O: i/ H. N8 H* E* {. B; J我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：
8 S1 b9 j7 u$ a( p0 E8 X  _9 T4 q4 [( D2 S+ p: V* e+ K/ N
1. 全基因组DNA提取( Q* X2 W$ z: h( g- f
2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端. W1 `$ t2 A! f2 d# [5 G
3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接
8 S$ D# U5 S, Y( ]! ^4. 1st-Round PCR
! y2 M, m% A9 c+ S& Q7 G  }0 j5. 2nd-Round PCR
& E+ Q$ j, v. h: G' j, s6. Sequencing3 M5 T6 m) p. H. `5 m
0 Y, |% s% b: F) Y/ D
现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
( i: T9 j, n" b% m因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
& f7 h: I2 J. ~3 _% \( k- C' D8 t& L) c, k9 Y& r0 f" w
比较着急，希望高人指点。谢谢~
* g. x4 [& K0 B! j7 ^1 @! I+ x& V) `2 J- b
附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子% p7 D5 B5 O1 _$ B5 A

1 a- s- a4 R# T5 @4 }谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

钻石星辰

) M6 ~7 X; j4 `  P: r& R$ ?* |9 G8 ?1 D6 Y; `3 t
回复 splinkerette 的帖子% X! v- i5 D3 t- W2 J% |/ p
+ s2 Z1 `( W& C  x- V2 M4 }/ q% E" _
你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。
, v, j: B% w( t1 c
) j6 b! S( b! {" k9 s' u/ u3 v不过，我还有两个小问题：
$ ~. `5 M* P- x* D& g2 {
, Q- q! G# D$ q5 X4 N8 a; Q) u1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。
- n5 ?; R0 K' U这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？
! W7 l/ n/ A5 g! n% r1 s- D$ |  N8 L3 S" W; }5 g! q
（没有用过NEB的酶不好意思）( I+ [+ F" j& I1 |/ c" U
6 H; M) G7 @/ Y/ y" B& Q  f
2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？
; L7 q* W0 j/ w9 G8 A8 `" d
8 k: h5 Z6 ]0 I& D+ t

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子
. l) |# i8 Z- ?$ g: W) X
% M- s; r) ]9 g% \& @, v谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子6 d: c/ L4 P' ^% S! b5 {" ?
5 F0 T5 r% z; @: k4 m; Q1 O
你好，请问我合成的splinkerette adaptor 没有按照Nature Method上要求的HPLC纯化，而是用PAGE纯化，对后续实验有影响吗？
2 I4 x; I+ q# u, u: p
! c" u6 n# k. y3 P! E5 @这两种纯化方式有什么不同呢？