关于Splinkerette PCR的一些疑惑

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LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

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附上文章

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呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

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回复 钻石星辰 的帖子; @$ U5 t5 h+ ]1 w! |" M8 s

1 U# l1 r" A5 F8 c; _% f你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。
7 F! [5 U1 O& v) `/ g% T. x5 O5 F  N* U, j. Z9 u4 O. s! ?
两个问题：$ W; u2 d% O+ `. |3 a# Z4 F4 }/ ?
1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，
5 I% d% G/ u5 p: K. J9 L至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。, P2 d+ }3 Z2 W: z

$ O' Q' k& K4 I) G2 P# D2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶
1 t( l. N/ b! u& y, k7 Z$ B附上一个图吧：6 p0 ]$ ~) N' D7 m

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回复 钻石星辰 的帖子
/ F: t- d4 I  ]: i9 S- J
; V' _9 [5 E5 RP.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

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回复 钻石星辰 的帖子9 p+ F- B' c5 E* b. W/ ?
% e9 ^* ^! G( U* ~) s- z
平时合成的普通引物，两头都是OH，我估计文章中所提到的不磷酸化，应该也是指5‘端的。不过这些个问题操作起来都不需要考虑的，直接把序列发过去合成就可以了

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回复 jiabiaohu 的帖子
, f: y# T8 ?& h5 z+ J4 o0 w. [! A2 r0 |  g$ |( y5 O% I2 Y
具体到结果上的差别我就也不清楚了，EcoRV 的酶切应该就是为了简化PCR的反应体系吧，或许能减少一些非特异性的反应。如果在你针对于“Transposable Elements”设计的下游引物之后有合适的酶切位点的话，我建议还是不妨一试。 不过至少我做的时候省略了那一步，也能出实验结果

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回复 jiabiaohu 的帖子
3 _7 Y: O; Y7 n' S4 z
0 F' b( k  I; l) Z0 r不好意思，我没有太看明白你的问题

splinkerette

回复 jiabiaohu 的帖子
/ U6 r% Q- F$ k$ ^9 ~* w; G% T4 V: T4 y% B- ?$ Z
对的，像我之前说的那样，类似于合成引物那样，直接送出去合成就OK了

splinkerette

回复 jiabiaohu 的帖子
/ i, y  y9 ~* S# x  o
5 k2 F& m* a4 S( |: y6 w呵呵，不客气，祝你实验顺利