关于bisulphite genome sequencing的问题

钻石星辰

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; x! W  P9 K! F6 ]大家好，最近我要开始通过bisulphite sequencing法检测Oct4，Sox2，Nanog启动子的甲基化程度。读了Yamanaka 06年4-factor的文献，他没有写bisulphite的参考文献，觉得有些地方不是太懂。+ I3 i1 w9 `, O3 F/ e/ ~1 X

7 D9 Y6 ]( R" {  [6 k$ v. O2 X问题1：为什么Yamanaka 06（包括以后所有有关iPS的文献基本上用的都是Yamanaka设计的引物）用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？Yamanaka 文献中只设计了甲基化引物，并没有设计非甲基化引物。这样会不会有检测不出部分甲基化的可能？
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问题2：Yamanaka 06 文献bisulphite结果图中的小圆圈代表的是CpG二核苷酸吗（附图）？这个结果是有专门软件做出来的还是自己画出来的？如果是CpG二核苷酸，我以Nanog为例，Yamanaka文献中Nanog共有60个圆圈，那么扩增出的片段应该有60个CpG二核苷酸。我查到它扩增出片段如下：
7 ~5 m7 X! G5 ~  Q
, p' S& N, k  {" `5 O- N  U“GACCCTGCAGGTGGGATTAACTGTGAATTCACAGGGCTGGTGGGGCGTGGGTGCCGCCTGGGTGCCTGGGAGAATAGGGGGTGGGTAGGGTAGGAGGCTTGAGGGGGGAGGAGCAGGACCTACCCTTTAAATCTATCGCCTTGAGCCGTTGGCCTTCAGATAGGCTGATTTGGTTGGTGTCTTGCTCTTTCTGTGGGAAGGCTGCGGCTCACTTCCTTCTGACTTCTTGATAATTTTGCATTAGACATTTAACTCTTCTTTCTATGATCTTTCCTTCTAGACACTGAGTTTTTTGGTTGTTGCCTAAAACCTTTTCAGAAATCCCTTCCCTCGCCATCACACTGACATGAGTGTGGGTCTTCCTGGT”
9 N3 q1 E$ F; M, \; R8 b: j# B6 l5 x3 I5 m: {( J' b+ k/ s  Y8 L
可是CpG二核苷酸的数量远没有60个啊？？？
& }1 |  H' ]& Y
) }8 R" D; O& |/ u4 y& s0 h问题3：求有关bisulphite sequencing的文献。
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3 y3 L) t3 j3 w
, W4 w" x. Q; ^( y7 A( q谢谢大家帮忙啦，祝小年快乐！~

realinter

研究生做了2年的Oct4，Sox2，Nanog启动子调控原件的研究花了也有七八万后来文章被拒了2次，就没继续做了，做分子真是花钱多，且不易出结果的活。

钻石星辰

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3 U" _6 K% l2 k* @( u) H% j请问你做过bisulphite相关的研究吗？

siyue13

楼上的真悲剧呀

siyue13

吃个元宵，消消火

realinter

没有哦，早就没火了呵呵

zlx0814

楼主，根据你提供的图片，应该是6个CG位点，分别作了10个重复测序。中文文献也很多，比如博硕论文，你找找看。
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甲基化引物同普通PCR引物一样，根据扩增片段而定，你的“用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？”理解有误，人们采用他的引物原因就是无需摸索可直接拿来所用。

sannia

1. bisulphite 引物是个混合物，既能扩出非甲基化的又能扩出甲基化的片段。但是为了提高扩增效率，一般找不含有C（或含有少量C，引物3‘端5个碱基内一定不能含有C）的序列片段，因为只有C在bisulphite前后是变化的，其他的碱基不变不影响扩增效率。! T9 W# L. g  N6 N( k" c
2. bisulphite测序 每个片段他测了10次，每个黑点代表一个甲基化的C，白点表示没有甲基化。有软件可以画，这个我不太记得是哪个了。
/ \* o8 q* l7 b/ _4 ~3. 本人blog上有一点浅显的理解，你可以参考：http://ygty.blogbus.com/logs/35910689.html   这篇是以拟南芥为材料的。植物和动物有点不太一样，动物只有CG甲基化，植物有三种，比动物中要复杂一些。

钻石星辰

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( B( K5 T. F8 n2 Q- Z4 e您好，您所说的每个片段测10次是指从哪步开始的平行10次？) G, a6 r1 N* ^& ^2 j

; p: O: a) K5 ?/ l3 r您的博客链接打开的是乱码，试了好几次都是这样。+ j3 z# [% p$ m& E3 r
, Q' O: }2 Q! R, H& c( d: x
谢谢~

sannia

我这打开没有问题啊。
- j+ Z4 |  z2 A) u6 h5 P试试这个：   
2 L' q+ R3 r$ P# d5 uhttp://ygty.blogbus.com
6 a' `$ B. p. h6 g8 I然后选左边链接生物学