关于bisulphite genome sequencing的问题

钻石星辰

3 c, f- [8 `8 ], u( ^1 s
" G! x7 g* C6 q/ V/ o
大家好，最近我要开始通过bisulphite sequencing法检测Oct4，Sox2，Nanog启动子的甲基化程度。读了Yamanaka 06年4-factor的文献，他没有写bisulphite的参考文献，觉得有些地方不是太懂。) n2 X# M0 w# r0 g' P3 l5 d( A4 ^

1 \% E( E8 t2 I- w7 E9 X问题1：为什么Yamanaka 06（包括以后所有有关iPS的文献基本上用的都是Yamanaka设计的引物）用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？Yamanaka 文献中只设计了甲基化引物，并没有设计非甲基化引物。这样会不会有检测不出部分甲基化的可能？
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' n+ i; n5 k; z8 x问题2：Yamanaka 06 文献bisulphite结果图中的小圆圈代表的是CpG二核苷酸吗（附图）？这个结果是有专门软件做出来的还是自己画出来的？如果是CpG二核苷酸，我以Nanog为例，Yamanaka文献中Nanog共有60个圆圈，那么扩增出的片段应该有60个CpG二核苷酸。我查到它扩增出片段如下：  A6 X+ E) ]6 e! y( D
( ^. P# j, F% J  v
“GACCCTGCAGGTGGGATTAACTGTGAATTCACAGGGCTGGTGGGGCGTGGGTGCCGCCTGGGTGCCTGGGAGAATAGGGGGTGGGTAGGGTAGGAGGCTTGAGGGGGGAGGAGCAGGACCTACCCTTTAAATCTATCGCCTTGAGCCGTTGGCCTTCAGATAGGCTGATTTGGTTGGTGTCTTGCTCTTTCTGTGGGAAGGCTGCGGCTCACTTCCTTCTGACTTCTTGATAATTTTGCATTAGACATTTAACTCTTCTTTCTATGATCTTTCCTTCTAGACACTGAGTTTTTTGGTTGTTGCCTAAAACCTTTTCAGAAATCCCTTCCCTCGCCATCACACTGACATGAGTGTGGGTCTTCCTGGT”) m" @% S/ U/ y$ V

: m* t& n! w! _1 V" Q2 P4 K可是CpG二核苷酸的数量远没有60个啊？？？
+ Y9 P4 J) m; D! @4 H/ @* d- j
  n5 ~+ B8 q$ H& u5 d2 r. F! l/ K问题3：求有关bisulphite sequencing的文献。: _9 t' m% R! M% E: K4 g
# u' B" H3 Y# u2 V# S

) ^! W, ~% u, ^) l5 a& S; A谢谢大家帮忙啦，祝小年快乐！~

realinter

研究生做了2年的Oct4，Sox2，Nanog启动子调控原件的研究花了也有七八万后来文章被拒了2次，就没继续做了，做分子真是花钱多，且不易出结果的活。

钻石星辰

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& B- I$ Z1 C8 c
8 A" a* \5 h# x- c$ f6 o3 j) `请问你做过bisulphite相关的研究吗？

siyue13

楼上的真悲剧呀

siyue13

吃个元宵，消消火

realinter

没有哦，早就没火了呵呵

zlx0814

楼主，根据你提供的图片，应该是6个CG位点，分别作了10个重复测序。中文文献也很多，比如博硕论文，你找找看。
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5 m9 j  h7 j. R/ `( K* j甲基化引物同普通PCR引物一样，根据扩增片段而定，你的“用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？”理解有误，人们采用他的引物原因就是无需摸索可直接拿来所用。

sannia

1. bisulphite 引物是个混合物，既能扩出非甲基化的又能扩出甲基化的片段。但是为了提高扩增效率，一般找不含有C（或含有少量C，引物3‘端5个碱基内一定不能含有C）的序列片段，因为只有C在bisulphite前后是变化的，其他的碱基不变不影响扩增效率。
; }& t# u* u3 T/ `+ s& _2. bisulphite测序 每个片段他测了10次，每个黑点代表一个甲基化的C，白点表示没有甲基化。有软件可以画，这个我不太记得是哪个了。+ G/ ^' s0 x) U3 ]$ P$ I0 q% i3 g
3. 本人blog上有一点浅显的理解，你可以参考：http://ygty.blogbus.com/logs/35910689.html   这篇是以拟南芥为材料的。植物和动物有点不太一样，动物只有CG甲基化，植物有三种，比动物中要复杂一些。

钻石星辰

回复 sannia 的帖子( w: \7 y- v% ]! l
; g7 G! M9 [- M
您好，您所说的每个片段测10次是指从哪步开始的平行10次？
' d# `: Z; `- }) b: c( r0 h+ e9 a. G! i# P6 M. R3 a% D; c
您的博客链接打开的是乱码，试了好几次都是这样。
! O1 m! @" f# z" t/ l3 ]% I1 I4 k, p3 S  d
谢谢~

sannia

我这打开没有问题啊。1 q9 ]) v& S4 a! A! y$ T4 `6 ~! {
试试这个：    - W* {: o8 |5 o: T9 _! j
http://ygty.blogbus.com
) f; |/ T7 j3 f8 z0 k然后选左边链接生物学