关于bisulphite genome sequencing的问题

钻石星辰

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0 ?* K0 ?5 g3 s/ J; h/ a大家好，最近我要开始通过bisulphite sequencing法检测Oct4，Sox2，Nanog启动子的甲基化程度。读了Yamanaka 06年4-factor的文献，他没有写bisulphite的参考文献，觉得有些地方不是太懂。
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问题1：为什么Yamanaka 06（包括以后所有有关iPS的文献基本上用的都是Yamanaka设计的引物）用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？Yamanaka 文献中只设计了甲基化引物，并没有设计非甲基化引物。这样会不会有检测不出部分甲基化的可能？
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问题2：Yamanaka 06 文献bisulphite结果图中的小圆圈代表的是CpG二核苷酸吗（附图）？这个结果是有专门软件做出来的还是自己画出来的？如果是CpG二核苷酸，我以Nanog为例，Yamanaka文献中Nanog共有60个圆圈，那么扩增出的片段应该有60个CpG二核苷酸。我查到它扩增出片段如下：( ^/ s" K- j, t7 Z
" W5 r, t/ x7 J
“GACCCTGCAGGTGGGATTAACTGTGAATTCACAGGGCTGGTGGGGCGTGGGTGCCGCCTGGGTGCCTGGGAGAATAGGGGGTGGGTAGGGTAGGAGGCTTGAGGGGGGAGGAGCAGGACCTACCCTTTAAATCTATCGCCTTGAGCCGTTGGCCTTCAGATAGGCTGATTTGGTTGGTGTCTTGCTCTTTCTGTGGGAAGGCTGCGGCTCACTTCCTTCTGACTTCTTGATAATTTTGCATTAGACATTTAACTCTTCTTTCTATGATCTTTCCTTCTAGACACTGAGTTTTTTGGTTGTTGCCTAAAACCTTTTCAGAAATCCCTTCCCTCGCCATCACACTGACATGAGTGTGGGTCTTCCTGGT”; A6 G  h  x) d9 i: p  \0 Y
6 j5 n6 g: p6 v4 K$ h! V
可是CpG二核苷酸的数量远没有60个啊？？？
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$ L, |: ~9 |8 r6 X+ N2 F问题3：求有关bisulphite sequencing的文献。' H* _  r/ P. Z; e; F

- M1 Z& ], K8 W7 y) \% R
8 g- Q& n" c% D+ t3 r7 {谢谢大家帮忙啦，祝小年快乐！~

realinter

研究生做了2年的Oct4，Sox2，Nanog启动子调控原件的研究花了也有七八万后来文章被拒了2次，就没继续做了，做分子真是花钱多，且不易出结果的活。

钻石星辰

回复 realinter 的帖子
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2 o9 Q/ y) [7 Q; c请问你做过bisulphite相关的研究吗？

siyue13

楼上的真悲剧呀

siyue13

吃个元宵，消消火

realinter

没有哦，早就没火了呵呵

zlx0814

楼主，根据你提供的图片，应该是6个CG位点，分别作了10个重复测序。中文文献也很多，比如博硕论文，你找找看。
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甲基化引物同普通PCR引物一样，根据扩增片段而定，你的“用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？”理解有误，人们采用他的引物原因就是无需摸索可直接拿来所用。

sannia

1. bisulphite 引物是个混合物，既能扩出非甲基化的又能扩出甲基化的片段。但是为了提高扩增效率，一般找不含有C（或含有少量C，引物3‘端5个碱基内一定不能含有C）的序列片段，因为只有C在bisulphite前后是变化的，其他的碱基不变不影响扩增效率。3 O% o& d: G; p- _$ d
2. bisulphite测序 每个片段他测了10次，每个黑点代表一个甲基化的C，白点表示没有甲基化。有软件可以画，这个我不太记得是哪个了。3 n. W; F" r7 |; U; `: j: I
3. 本人blog上有一点浅显的理解，你可以参考：http://ygty.blogbus.com/logs/35910689.html   这篇是以拟南芥为材料的。植物和动物有点不太一样，动物只有CG甲基化，植物有三种，比动物中要复杂一些。

钻石星辰

回复 sannia 的帖子! e. l2 w/ d& B7 D6 ]/ a( T
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您好，您所说的每个片段测10次是指从哪步开始的平行10次？
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/ A  y2 I; j0 V  j4 O) v您的博客链接打开的是乱码，试了好几次都是这样。- C0 j1 x6 h; b1 ?- A: w8 m

/ w, m& G7 b6 }1 N" d, K, m谢谢~

sannia

我这打开没有问题啊。
. L* ]( j* N( s5 n. \) i5 V试试这个：   
: W9 `8 I7 K  ]# ^/ hhttp://ygty.blogbus.com
2 c  j+ x) b$ E1 Q: a然后选左边链接生物学