关于bisulphite genome sequencing的问题

钻石星辰

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! k- X0 f) ^- L, \. W% C5 E1 g大家好，最近我要开始通过bisulphite sequencing法检测Oct4，Sox2，Nanog启动子的甲基化程度。读了Yamanaka 06年4-factor的文献，他没有写bisulphite的参考文献，觉得有些地方不是太懂。; H1 J5 J  }9 `% B# R
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问题1：为什么Yamanaka 06（包括以后所有有关iPS的文献基本上用的都是Yamanaka设计的引物）用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？Yamanaka 文献中只设计了甲基化引物，并没有设计非甲基化引物。这样会不会有检测不出部分甲基化的可能？
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% J5 b' T3 R, ~  u3 X问题2：Yamanaka 06 文献bisulphite结果图中的小圆圈代表的是CpG二核苷酸吗（附图）？这个结果是有专门软件做出来的还是自己画出来的？如果是CpG二核苷酸，我以Nanog为例，Yamanaka文献中Nanog共有60个圆圈，那么扩增出的片段应该有60个CpG二核苷酸。我查到它扩增出片段如下：
3 [2 q2 z/ U" {' c  r4 _; c; y$ L0 _8 F9 z; Z) j! Q
“GACCCTGCAGGTGGGATTAACTGTGAATTCACAGGGCTGGTGGGGCGTGGGTGCCGCCTGGGTGCCTGGGAGAATAGGGGGTGGGTAGGGTAGGAGGCTTGAGGGGGGAGGAGCAGGACCTACCCTTTAAATCTATCGCCTTGAGCCGTTGGCCTTCAGATAGGCTGATTTGGTTGGTGTCTTGCTCTTTCTGTGGGAAGGCTGCGGCTCACTTCCTTCTGACTTCTTGATAATTTTGCATTAGACATTTAACTCTTCTTTCTATGATCTTTCCTTCTAGACACTGAGTTTTTTGGTTGTTGCCTAAAACCTTTTCAGAAATCCCTTCCCTCGCCATCACACTGACATGAGTGTGGGTCTTCCTGGT”
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3 u% `. A5 J* R. t3 g可是CpG二核苷酸的数量远没有60个啊？？？
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; h! ]5 q- H9 H. L% ~问题3：求有关bisulphite sequencing的文献。# o* s9 t! C+ |* k0 ~+ ], e  \

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谢谢大家帮忙啦，祝小年快乐！~

realinter

研究生做了2年的Oct4，Sox2，Nanog启动子调控原件的研究花了也有七八万后来文章被拒了2次，就没继续做了，做分子真是花钱多，且不易出结果的活。

钻石星辰

回复 realinter 的帖子) y! E2 p$ O- p! s: J! ]: ~

& E5 o2 E4 d5 O# F7 N# J0 f请问你做过bisulphite相关的研究吗？

siyue13

楼上的真悲剧呀

siyue13

吃个元宵，消消火

realinter

没有哦，早就没火了呵呵

zlx0814

楼主，根据你提供的图片，应该是6个CG位点，分别作了10个重复测序。中文文献也很多，比如博硕论文，你找找看。
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甲基化引物同普通PCR引物一样，根据扩增片段而定，你的“用的bisulphite sequencing引物只有1对？而不是两对？”理解有误，人们采用他的引物原因就是无需摸索可直接拿来所用。

sannia

1. bisulphite 引物是个混合物，既能扩出非甲基化的又能扩出甲基化的片段。但是为了提高扩增效率，一般找不含有C（或含有少量C，引物3‘端5个碱基内一定不能含有C）的序列片段，因为只有C在bisulphite前后是变化的，其他的碱基不变不影响扩增效率。
  ]' I9 O9 h+ g( G2. bisulphite测序 每个片段他测了10次，每个黑点代表一个甲基化的C，白点表示没有甲基化。有软件可以画，这个我不太记得是哪个了。
0 z  s/ \, c, i% l) q3. 本人blog上有一点浅显的理解，你可以参考：http://ygty.blogbus.com/logs/35910689.html   这篇是以拟南芥为材料的。植物和动物有点不太一样，动物只有CG甲基化，植物有三种，比动物中要复杂一些。

钻石星辰

回复 sannia 的帖子
6 g4 O+ a* A0 \! g  Y6 Q" }0 h
. x& Y6 C( U+ z2 b; n) d) T, B3 ]您好，您所说的每个片段测10次是指从哪步开始的平行10次？
+ g# z( P3 E7 M6 R' ?) O& A! s0 H; S8 w2 a$ J/ C
您的博客链接打开的是乱码，试了好几次都是这样。
8 F  ^. z* {% J7 X7 z# E( r
- T# x9 S7 f0 J% d5 u谢谢~

sannia

我这打开没有问题啊。
/ ]8 Z( G& _' \+ y" e. w试试这个：    6 F- C5 A- t. n' M) Y# m
http://ygty.blogbus.com4 P/ F" \* k  b. w3 B; g
然后选左边链接生物学