绵羊脐带间充质干细胞，无文献摸索-Ⅱ 细胞诱导分化鉴定

皮搋子

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/ c0 z1 t3 j- L# k4 H/ q+ [8 m写这个帖子一个是求助，另外一个是方便各位打算做诱导分化的各位同仁，有道是看万卷书不如听达人一句指点啊！& }2 V3 I, w1 z! k

3 E7 g8 A( B9 `% y: A6 r* i在这里真诚的感谢坛子里面所有帮助我的人，同时真心的希望这些帖子中的达人的回复能帮助到做MSC培养的同行。
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9 O, M& x# [0 x; i# K所以请版主帮忙，等待我的系列帖子发完之后能做个汇编，把出现的问题做个汇总，谢谢！* \  a) ^" J* c$ v! J
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好，言归正传，自从昨天听取了各位达人的建议后，特别是“guosapphire”的建议相当中肯，做诱导分化是势在必行啊！也谢谢get0715的建议，我就决定做干细胞向骨骼和脂肪细胞的诱导分化了！
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, Y' c+ u* \% e) e5 k' i7 Y说做咱就做，分瓶先！3 c( Y; T( j. b5 j0 j: P

7 W7 c! w9 L& a6 M4 S: k取一个长满的175cm的瓶子，传代分成9个小瓶。（为啥分小瓶？省钱不是，大瓶子太贵了，20元一个呢，而且费血清费的要死），其中3个瓶子做阴性对照，3个瓶子做骨骼诱导，3个做脂肪诱导。
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9 f- _  Q4 ]; q2 n, w; B; }下面的部分还没有开始，正在计划中，现在万事不具备，细胞也没融合。。。
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因为我悲催的发现查到的文献中的好多东西不懂。。。但我会实时的进行报告进展。
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问题1：为啥要细胞融合了才能做诱导分化？
1 |- q* V, [) h答 案：因为加入诱导分化剂之后细胞会停止生长，而且会死掉相当一部分。之所以让细胞长满到融合的程度是为了多拉上几个炮灰，才能保证21天之后不全是坏蛋。（这个答案感谢我媳妇的教诲和指导）, d# |, G7 e) D
至于融合成啥样才算好呢？看图！
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% h' ^# g' K, ?. T' z, V$ |
7 X! ?% r$ G5 ^- C# C问题2：啥是油红“O”染色？为啥我查的文献中都是做组织切片？苍天大地，那可是费老鼻子劲了！这玩意染的方便不？需要啥神器吗？
- D3 D/ ?& x. h, b- u! Z: g# g8 ]
问题3：啥是碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色？必须都做吗？
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问题4：染这玩意简单不？我们这里刚开始养细胞，我需要什么仪器吗？那个倒置显微镜就不要讲了。8 L6 J5 N5 @# S. x6 E; E9 A

* w5 K" D% V# i8 F. w2 I5 M* q; R: Y* p
附：文献查到的方法，供大家参考指正。0 M9 V8 _: b) v
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向成骨细胞诱导分化:
" [4 v0 H+ e/ t5 C以成骨诱导培养基培养(DMEM/F12培养基,100 mL/L FBS、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸)每3~4 d全量换液1次,培养至第4周时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色。  |2 C+ Q" e( ^# `
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向脂肪细胞诱导分化:
+ k* A; y2 O5 I7 [以成脂肪诱导培养基培养(DMEM/F12培养基,10mL/L FBS、地塞米松1μmol/L、胰岛素5 u/mL、吲哚美辛0.5μmol/L),每3~4 d全量换液1次,培养至第21天时作油红“O”染色。0 ~" O' h8 u/ J1 I) K. a

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皮搋子

回复 tangyvhuang 的帖子
! c4 m' M+ i6 W$ [  b9 T! G( _. f3 X7 i: o" `
谢谢tangyvhuang达人，有两点不明白的地方：
1 w7 B& L) m. X1.配这个不需要无菌吧？反正只是观察，那个圣器是玩笑吧。
4 t9 D1 c$ O3 U2.那个油红的过滤是用什么过滤？滤器？滤纸？规格是多少的啊？, B; T" h5 O, R4 G, M0 [
3.甲醛固定是用多少量呢？固定多久？什么样的状态才算固定好？) Z7 s1 g7 Y1 l! w/ D) v6 r
4,那个冲洗的过程是用什么冲洗啊？生理盐水？还是蒸馏水？

皮搋子

回复 tangyvhuang 的帖子
: K0 ~( f- t. p- O# M3 J$ J8 a( u' L+ C
α萘酚磷酸钠 35mg+坚牢蓝RR 35mg 溶于35ml0.05M丙二醇，这个是什么染色法？8 Y  u. [8 x; O7 d; K" J
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我怎么找不到这个染色法？是碱性磷酸酶钙钴法染色法吗？

皮搋子

回复 金戈 的帖子
3 r/ i$ x& _; V2 U* [- ?% g& k. {
能提供一下钙茜素红染色法的配方和染色方法吗？

皮搋子

0 y1 U, X3 N8 {4 q& U9 f* k
, ~/ V/ ?" k- E# U! R8 Y
转载一下noodleaf在一个帖子中的建议，供大家参考： 另外也问一下noodleaf，你那个配液方法貌似很难理解。。。请问配液是多少D/F12加上1nM 地塞米松. B以及其他的？看的人相当无解啊，本来非常详细的一个技术贴，因为这个原因，根本没法用。
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* b7 k; ?8 C+ W: w& P9 y$ i向成骨细胞诱导分化
- A1 R% K( B9 ?4 ]成骨细胞诱导液： 9 y; _5 ~7 y4 D6 b3 O  }
D/F12( 10%FBS)/ L  z4 d  f+ W  A# g* N
1nM 地塞米松. B
: P+ z+ _9 F& g0 ?50 mM 维生素C
6 a. [$ W4 a' j. k% [10mM 甘油磷酸钠. h6 _# l7 J' @5 }* V4 E
每3-4d换液1次，诱导至21d检测。
" q; j0 T' E1 @# s  G2 E2.        检测方法
: Q: c- U# J( r7 i1)        光镜下观察：可见黑色不透明区域，肉眼可见白色结节时，进行染色检查；- Z. h/ Y7 p6 |2 _- f1 X
2)        茜素红染色检测：染色2-3min。
) x" Y0 S) ]& ?3)        成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色：
( t1 _; B! P  ?3.        配液：* g- ~# M! P% G8 S& x- B' p
1)        1uM 地塞米松3 G# v) w( l& Z$ b# b, Q5 I
2)        50 mM 维生素C3 y& G1 a5 a9 {3 @; D3 [
3)        10mM 甘油磷酸钠
2 ~' F2 z5 n& }% B4)        2%茜素红：取2g茜素红，溶于100ml95%乙醇溶液中，搅拌，与900ml 1% 氢氧化钾溶液相混。
; n% T8 c. s  i, ~# N7 B* _$ U  N/ Q$ P: E: M
向脂肪细胞诱导分化2 a: j- D! v) t, X  Q# M& G. o
脂肪细胞诱导液：   
' M: R) f  j0 b: J+ |/ K$ eD/F12( 10%FBS)
* W$ X/ x0 v$ Y+ V3 E) k6 R+ k9 D, v1uM 地塞米松% o  s$ \- h) K  p
0.5mM  IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）
! r0 A. E- _; W  E100ug/ml 消炎痛
1 Y( a9 b) q9 Q10ug/ml 胰岛素
) Z' x" ^$ j4 L3 o5 }6 I/ X每3-4d换液1次，诱导至14d检测。
: f% Z- o' U) u$ }# t2 ^; E/ K+ w2.        检测方法：* ~) v% g7 L' G% @% O! G
1)        光镜下观察：有成串的脂滴形成后（约10d），进行染色检查；
" \4 K- V) e7 X9 {4 Z8 Q4 @2)        油红O染色检测：染色30min。$ T4 [/ B, D. X: w& o7 Y
3.        配液：& R; B4 O+ Q3 f1 u$ ?2 R( p
1)        0.5uM  IBMX：8 K% C6 v, _& O# N
2)        100ug/ml 消炎痛：' h1 h  }- ]1 G) b  A% i
3)        10ug/ml 胰岛素：9 i! c" b' B7 d7 T2 S( ^  J, B
4)        油红O：油红干粉0.5g，溶于100ml异丙醇中，使用前以油红贮存液：去离子水＝3:2的比例稀释成工作液使用。
4 M0 b" E4 y. c( i" [8 b6 I# h) U7 ^+ v) I8 x9 x/ n
向软骨细胞诱导分化( D( m! ?9 g: r  [
软骨细胞诱导液：+ f9 I, X! r4 X. H1 D8 e! h
D/F12( 5%FBS)6 S6 V; ?/ n# m0 L/ C7 o& W% v
10 ng/ml TGF-β1+ v1 G3 N6 I# ^3 X7 M; n1 ~: j
0.1uM 地塞米松
' h! G3 |# j; ?) _/ T1 I( [50 mg 维生素C- n+ }+ \& F* a. K! Q
同时以未诱导MSCs作为对照。培养箱内进行培养，每3-4d 换液一次。诱导至21d后，进行相应检测。
% g2 F9 }& ^  `2.        组织化学和免疫组织化学分析)# E0 g/ C  v4 y9 {+ E2 l) ^% J
1)        显微镜观察：在倒置显微镜下，MSCs成软骨诱导分化后，细胞胞体变圆，胞质减少。
2 ?! L1 ~1 W# ?, p! e" ?+ W: F2)        番红O染色：诱导分化14d后，移出培养基，生理盐水/PBS洗12孔板一次，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，1%番红O染色约3min，蒸馏水洗3次，95%乙醇洗3遍，光学显微镜下观察并采集图像。7 C% _2 {# o, l( j$ {# \) {8 J+ n
3)        甲苯胺兰染色：染色2-4h。
& T( A: I& ]+ h! D( _$ e6 n4)        阿利辛兰染色：染色2 C5 E9 c/ K; E$ r
5)        Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：
. n3 G; I$ T# x0 A3.  配液（1L）+ C/ c, i& X8 t6 t, z8 d
1)  0.1uM 地塞米松：3.9*10-5g
$ d: X& g8 a( c& R0 j2)  50 uM 维生素C：8.8*10-3g3 P- \$ T4 E* a8 _6 N$ y
3)  10 ng/ml TGF-β1：10ug/L- a2 K$ i2 d: I5 j5 w
4)  番红O配方：番红O  0.5g  95%酒精  50ml。' p# N" |5 a, S7 J- i
5)  甲苯胺兰配方：甲苯胺兰   0.5g   0.1M PBS  50ml，调节pH7.2-7.4。4 ^/ T3 a& Y$ f& D/ W
6)  阿新蓝染液(PH2.5)：阿新蓝(8G×)1.0g、3%醋酸100ml。调整ph为2.5。