绵羊脐带间充质干细胞，无文献摸索-Ⅱ 细胞诱导分化鉴定

皮搋子

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写这个帖子一个是求助，另外一个是方便各位打算做诱导分化的各位同仁，有道是看万卷书不如听达人一句指点啊！8 H! {8 b1 l( |- S7 Z) A- O7 u5 p

/ B! x- P: Q- ^; G在这里真诚的感谢坛子里面所有帮助我的人，同时真心的希望这些帖子中的达人的回复能帮助到做MSC培养的同行。
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6 C' d/ j0 s2 \$ T5 r. n/ h8 O5 _. O所以请版主帮忙，等待我的系列帖子发完之后能做个汇编，把出现的问题做个汇总，谢谢！* S) q, e5 R1 K3 ^

7 w! p; X5 f+ m) C7 b好，言归正传，自从昨天听取了各位达人的建议后，特别是“guosapphire”的建议相当中肯，做诱导分化是势在必行啊！也谢谢get0715的建议，我就决定做干细胞向骨骼和脂肪细胞的诱导分化了！
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说做咱就做，分瓶先！
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: h# K% d4 O% b3 R; e取一个长满的175cm的瓶子，传代分成9个小瓶。（为啥分小瓶？省钱不是，大瓶子太贵了，20元一个呢，而且费血清费的要死），其中3个瓶子做阴性对照，3个瓶子做骨骼诱导，3个做脂肪诱导。9 ~! Y  c( E: O. ~

2 M' I2 G% d7 ^# ?下面的部分还没有开始，正在计划中，现在万事不具备，细胞也没融合。。。
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因为我悲催的发现查到的文献中的好多东西不懂。。。但我会实时的进行报告进展。) _. I" \: e$ M$ J, T. I
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问题1：为啥要细胞融合了才能做诱导分化？
6 k" ^, i/ V1 i2 S" r答 案：因为加入诱导分化剂之后细胞会停止生长，而且会死掉相当一部分。之所以让细胞长满到融合的程度是为了多拉上几个炮灰，才能保证21天之后不全是坏蛋。（这个答案感谢我媳妇的教诲和指导）; O; L1 c9 ]1 X
至于融合成啥样才算好呢？看图！( i6 l, G3 x4 D7 [4 F, w+ o; E# q
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问题2：啥是油红“O”染色？为啥我查的文献中都是做组织切片？苍天大地，那可是费老鼻子劲了！这玩意染的方便不？需要啥神器吗？
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问题3：啥是碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色？必须都做吗？! K+ G9 K2 a& ~+ x7 K; t' l

& j! s4 n1 C, o# e/ M' D4 T0 |7 x问题4：染这玩意简单不？我们这里刚开始养细胞，我需要什么仪器吗？那个倒置显微镜就不要讲了。4 i. g3 X8 S# g1 V8 r# k2 w. ^7 H3 M
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* \) o& b2 H$ M: v1 E" e' `附：文献查到的方法，供大家参考指正。
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2 }+ Q& V* x1 v/ ^$ ^) i$ [, i向成骨细胞诱导分化:! ~) |" A+ N! J9 Z0 Q, ^
以成骨诱导培养基培养(DMEM/F12培养基,100 mL/L FBS、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸)每3~4 d全量换液1次,培养至第4周时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色。
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; u, T2 Y' N$ K向脂肪细胞诱导分化:
7 u% z( {. M7 {: Y* ?& e/ X( k# G以成脂肪诱导培养基培养(DMEM/F12培养基,10mL/L FBS、地塞米松1μmol/L、胰岛素5 u/mL、吲哚美辛0.5μmol/L),每3~4 d全量换液1次,培养至第21天时作油红“O”染色。. R% p) \" D9 h+ F' x
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皮搋子

回复 tangyvhuang 的帖子
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% W# N  l7 Z4 i% b5 I1 |' w! K/ q谢谢tangyvhuang达人，有两点不明白的地方：
8 x1 L. D7 w+ S& b1.配这个不需要无菌吧？反正只是观察，那个圣器是玩笑吧。
4 s' {( t( N$ r8 D2.那个油红的过滤是用什么过滤？滤器？滤纸？规格是多少的啊？7 e) U3 N" |6 c8 y# h
3.甲醛固定是用多少量呢？固定多久？什么样的状态才算固定好？
4 [1 x5 g7 W9 x# |1 }0 u4,那个冲洗的过程是用什么冲洗啊？生理盐水？还是蒸馏水？

皮搋子

回复 tangyvhuang 的帖子
% k0 w6 }( V# a& j" j4 R# X; b% S4 q8 k3 S) [
α萘酚磷酸钠 35mg+坚牢蓝RR 35mg 溶于35ml0.05M丙二醇，这个是什么染色法？
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$ e  H1 H$ N' A* L2 W8 U我怎么找不到这个染色法？是碱性磷酸酶钙钴法染色法吗？

皮搋子

回复 金戈 的帖子
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能提供一下钙茜素红染色法的配方和染色方法吗？

皮搋子

  K( _( Q9 U: N7 V0 ?/ D$ t7 O% s* q, i: x# F9 a; c7 c
转载一下noodleaf在一个帖子中的建议，供大家参考： 另外也问一下noodleaf，你那个配液方法貌似很难理解。。。请问配液是多少D/F12加上1nM 地塞米松. B以及其他的？看的人相当无解啊，本来非常详细的一个技术贴，因为这个原因，根本没法用。
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向成骨细胞诱导分化, N' v2 G) j/ y* x" N* U* t" d
成骨细胞诱导液：
) t9 g3 y/ E- E6 V) Q) `: i0 aD/F12( 10%FBS)
3 o6 |1 ]8 T$ w) ^1nM 地塞米松. B
9 B: {+ l% A7 s50 mM 维生素C1 u1 N1 L+ P7 Z6 H6 v. ?1 l
10mM 甘油磷酸钠
& Z" ~, Y* f4 p* y每3-4d换液1次，诱导至21d检测。
0 R8 U) D: e) A5 \3 _2.        检测方法
& E. q. p" Q' e3 S3 ~7 M8 C1)        光镜下观察：可见黑色不透明区域，肉眼可见白色结节时，进行染色检查；% O9 T7 Y9 o* `1 v* f0 L: Z
2)        茜素红染色检测：染色2-3min。
; g6 \4 e3 s' X* i3)        成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色：
+ ~& s( E9 T8 F4 o5 {9 r3.        配液：, N- X: S: ~; c
1)        1uM 地塞米松
6 z) Y# x; W  s* m$ a$ {. [2)        50 mM 维生素C( m' _4 d# Y- I5 Y' g0 D
3)        10mM 甘油磷酸钠- u: h9 h" }6 d+ Y% g0 C
4)        2%茜素红：取2g茜素红，溶于100ml95%乙醇溶液中，搅拌，与900ml 1% 氢氧化钾溶液相混。" e$ W! @. w- N' @5 x) q" b
% M: Y! O1 }, `/ Y# c7 M
向脂肪细胞诱导分化
) _% B4 X$ \; ^脂肪细胞诱导液：   
- ^; l' S! x, q4 }D/F12( 10%FBS), r7 L) r  L# l  x$ u
1uM 地塞米松
% e" p* v# V, |1 y0.5mM  IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）) x9 H" l$ |- R, i  ^8 w
100ug/ml 消炎痛! b) W& n; p3 d% I7 ]# a9 Q1 D
10ug/ml 胰岛素- f+ |* X/ y. f% e0 _3 l9 C
每3-4d换液1次，诱导至14d检测。
9 y8 g% h. M5 Y: s3 Q  u2.        检测方法：! F  G1 g% |2 n, T
1)        光镜下观察：有成串的脂滴形成后（约10d），进行染色检查；+ R# Y: f- J7 z- k3 A. ^8 R" N
2)        油红O染色检测：染色30min。2 X: [0 t$ g4 X6 a8 L3 l( i" e
3.        配液：
1 k; R- [9 w& a( {1)        0.5uM  IBMX：7 q* @6 o+ F# E0 {$ U; j3 k9 t
2)        100ug/ml 消炎痛：1 O- E! h9 i. p" [6 ^* B- F4 N% k
3)        10ug/ml 胰岛素：4 C! L& [0 J3 u( u5 x" o
4)        油红O：油红干粉0.5g，溶于100ml异丙醇中，使用前以油红贮存液：去离子水＝3:2的比例稀释成工作液使用。
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向软骨细胞诱导分化, L" |* |$ q- g. q/ f* V* I
软骨细胞诱导液：! `4 ~  t. a, y
D/F12( 5%FBS)
! B' ^* `6 C0 I10 ng/ml TGF-β1
+ E* J- b/ d( O* |; `0 b/ T0.1uM 地塞米松4 t* [0 r9 j) s% l+ Z
50 mg 维生素C
! e* t: m/ ?6 b9 L  \: E同时以未诱导MSCs作为对照。培养箱内进行培养，每3-4d 换液一次。诱导至21d后，进行相应检测。9 R4 _1 z# A+ p. [" {& t
2.        组织化学和免疫组织化学分析)1 f" h' P& W! C. l) A" v0 v
1)        显微镜观察：在倒置显微镜下，MSCs成软骨诱导分化后，细胞胞体变圆，胞质减少。
9 ?5 ^9 D! Z( x6 A2)        番红O染色：诱导分化14d后，移出培养基，生理盐水/PBS洗12孔板一次，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，1%番红O染色约3min，蒸馏水洗3次，95%乙醇洗3遍，光学显微镜下观察并采集图像。3 _8 A+ J1 l! u; h' E
3)        甲苯胺兰染色：染色2-4h。
4 p& ~6 i, M8 A: @" W1 x4)        阿利辛兰染色：染色5 z% F# [1 q1 ]2 D
5)        Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：- O2 s* e6 q1 A: s' A# J
3.  配液（1L）. b5 J+ ?" y, Y
1)  0.1uM 地塞米松：3.9*10-5g
% T# d, `3 s9 U" ]( r+ [3 _2 d2)  50 uM 维生素C：8.8*10-3g
) }3 |) p' z! ^, P; ]6 e3)  10 ng/ml TGF-β1：10ug/L
. C! w2 I8 q* U: C" B! }% \: k4)  番红O配方：番红O  0.5g  95%酒精  50ml。+ L4 v5 P4 N: A9 ]0 |9 _4 J
5)  甲苯胺兰配方：甲苯胺兰   0.5g   0.1M PBS  50ml，调节pH7.2-7.4。
" L" L* P+ U# E5 C) J6)  阿新蓝染液(PH2.5)：阿新蓝(8G×)1.0g、3%醋酸100ml。调整ph为2.5。