绵羊脐带间充质干细胞，无文献摸索-Ⅱ 细胞诱导分化鉴定

皮搋子

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写这个帖子一个是求助，另外一个是方便各位打算做诱导分化的各位同仁，有道是看万卷书不如听达人一句指点啊！
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, ]/ q) l9 I3 H; S在这里真诚的感谢坛子里面所有帮助我的人，同时真心的希望这些帖子中的达人的回复能帮助到做MSC培养的同行。1 b) Z+ ~$ Z( x+ k! J# E
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所以请版主帮忙，等待我的系列帖子发完之后能做个汇编，把出现的问题做个汇总，谢谢！: m% Q3 q4 |8 z, W0 g/ r( \  h

6 S9 S0 u8 T, K0 E. s9 q好，言归正传，自从昨天听取了各位达人的建议后，特别是“guosapphire”的建议相当中肯，做诱导分化是势在必行啊！也谢谢get0715的建议，我就决定做干细胞向骨骼和脂肪细胞的诱导分化了！( M$ t1 B( |! c- ~$ V; N

! @. D; w3 Q1 c8 @2 l/ y说做咱就做，分瓶先！  o3 i& o( o6 S" ?2 O

& r' e! e* r1 H% [$ u取一个长满的175cm的瓶子，传代分成9个小瓶。（为啥分小瓶？省钱不是，大瓶子太贵了，20元一个呢，而且费血清费的要死），其中3个瓶子做阴性对照，3个瓶子做骨骼诱导，3个做脂肪诱导。
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  p. U7 e+ L3 N5 Y# ?. L下面的部分还没有开始，正在计划中，现在万事不具备，细胞也没融合。。。
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因为我悲催的发现查到的文献中的好多东西不懂。。。但我会实时的进行报告进展。
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问题1：为啥要细胞融合了才能做诱导分化？6 R3 n( _: s4 {/ a. s6 `
答 案：因为加入诱导分化剂之后细胞会停止生长，而且会死掉相当一部分。之所以让细胞长满到融合的程度是为了多拉上几个炮灰，才能保证21天之后不全是坏蛋。（这个答案感谢我媳妇的教诲和指导）3 y! m- \- U1 I
至于融合成啥样才算好呢？看图！
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; A6 ^& b1 P- z6 j问题2：啥是油红“O”染色？为啥我查的文献中都是做组织切片？苍天大地，那可是费老鼻子劲了！这玩意染的方便不？需要啥神器吗？
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问题3：啥是碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色？必须都做吗？# R5 {' Y! h- J9 i
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问题4：染这玩意简单不？我们这里刚开始养细胞，我需要什么仪器吗？那个倒置显微镜就不要讲了。- m8 T: K/ Q! V2 X* F2 N8 |% [
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. F$ \% `: D- Q# F' p" \6 f附：文献查到的方法，供大家参考指正。
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2 H9 i2 A+ l2 X0 B' @# B向成骨细胞诱导分化:/ t/ M1 g5 R* h# P3 b/ |
以成骨诱导培养基培养(DMEM/F12培养基,100 mL/L FBS、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸)每3~4 d全量换液1次,培养至第4周时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色。
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+ ?' `  R! D: W% d% Y, T) Q- ^向脂肪细胞诱导分化:6 O/ X" ^$ v+ e: Q8 H8 B
以成脂肪诱导培养基培养(DMEM/F12培养基,10mL/L FBS、地塞米松1μmol/L、胰岛素5 u/mL、吲哚美辛0.5μmol/L),每3~4 d全量换液1次,培养至第21天时作油红“O”染色。
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tangyvhuang

说实话，做过诱导，但是也不精通，更没做过绵羊的，, m. [) D$ M. y! X
第一个问题，那个融合好了的才去诱导分化，我做的都是80%时候去诱导的，没有那么满，脂肪的诱导比较快的，两天就看出来油滴出现，细胞少了好多，大戒指的样子很明显，第四天我去染色了，结果还不错。成骨的诱导有点慢了，但细胞也是在生长的呢？我还传了两次代呢期间。

tangyvhuang

油红O 是红色粉末，很好买的。染色很方便的，神器用不到，但是你得用圣器盛着，( Z+ ]& `$ P. c  I# @3 H# f1 u
我们是用0.5g 溶于100ml异丙醇中室温放置备用，用的时候直接吸取6ml加入4ml的蒸馏水混合好了之后过滤一下用于染色，
) ]" q( ^; r8 w7 N细胞先用10%的甲醛固定然后在染色，染色15min后冲洗干净观察就好了。
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5 c. X" ^' u+ B2 |对于成骨的诱导染色，一种染色方法就行，我们用的是α萘酚磷酸钠 35mg+坚牢蓝RR 35mg 溶于35ml0.05M丙二醇，这个染色液去染色30min之后冲洗观察，也是先10%的甲醛固定。: D  `6 G% Z: X! L; v

- x8 u0 j1 x+ p. C( p不用其他的设备了吧，有个显微镜够了( d! I5 a! j# @+ _4 f* f
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tangyvhuang

诱导剂加的东西都一样，就是地敏的浓度有差异，不知道

皮搋子

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谢谢tangyvhuang达人，有两点不明白的地方：
; D& O% A1 u9 V4 P0 T% }+ q2 O1.配这个不需要无菌吧？反正只是观察，那个圣器是玩笑吧。
9 F9 {  {7 P: e5 \" `2.那个油红的过滤是用什么过滤？滤器？滤纸？规格是多少的啊？  H! N) g5 D* \$ g1 C
3.甲醛固定是用多少量呢？固定多久？什么样的状态才算固定好？, s2 B( {0 h1 U4 D9 y+ I
4,那个冲洗的过程是用什么冲洗啊？生理盐水？还是蒸馏水？

金戈

回复 皮搋子 的帖子% ?( B2 F- g, o: @' r! ~) k& N. m
, q1 y. G+ R9 \6 d8 F# {; g1 ~
to question1：并不是要细胞完全融合了才能做诱导分化。如果完全融合了才开始诱导的话，你的细胞坚持不了那么多天就会因为太密而脱落。一般70-80%融合就可以做诱导了。因为干细胞具有增殖和分化的潜能，是决定细胞增殖呢还是向其他方向分化，与细胞的环境有关。为什么细胞长满了要不断传代才能保持其干细胞的特性而不向成熟细胞分化的原因。向如上所示，我个人觉得细胞长的太密了。（谨供参考）
# D( x, y4 A3 N  o7 l9 Xto question2：油红"O"，示一种化学染料，能将组织或脂肪细胞染成红色。比较便宜，也比较好用。配好的油红O最好用滤纸过滤一下，去掉沉渣和杂质。
6 M( D( l9 I+ {) c, N/ jto question3：碱性碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色都是鉴定成骨细胞的染色方法。两种做一种就可以了。我两者都做过。对比而言，钙茜素红染色比较简单，跟油红染色相似，步骤比较简单，固定和染色。而碱性碱性磷酸酶钙钴法染色比较复杂些，我不知道有没有现成的染液买，我当时是全部自己配置的，所以很麻烦，还有H2S，超级臭。。。。6 M8 K  C) a1 ], ?% |% \9 v" H
to question4： 染色还好，只要固定好。固定的时候要注意操作，别等你固定完细胞已经都不见了，那就亏大发了。养细胞需要CO2培养箱，最好要有操净工作台。染色不需要什么仪器。
* I, b. o  ]1 e+ d" H/ B  V5 p' ? 关于绵羊MSC，做的人可能比较少，但是这些方法都是通用的，不管是人的，鼠的等等。而且都是MSC细胞，所以特性也相近。所以可以参照其他物种的方法来做，没有问题的。
2 ~7 Y! R2 `* _: C" c' p% Q另外，其实成脂诱导，脂肪细胞很特点很明显，其实没染色也能看出来了的。比较好做。: r0 F& U9 ]! g( v% M4 e
GOD BLESS YOU!

金戈

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$ a$ E4 N% W5 P$ ~5 [! WTO 1: 染液不需要无菌。
, R* S& M7 X; sTO2: 油红用一般的滤纸过滤就可以了。主要是去掉很多杂质，影响染色背景。
/ t/ v( g4 B. N& F  a9 O5 ATO3：固定液没过细胞就可以了。一般5min左右
- \9 D) b6 S9 ?0 FTO4：染色过程中，洗弃培养基，可以用DPBS或者PBS或者用生理盐水也可以，洗2次，然后固定。固定后，以及染色后洗，用生理盐水、蒸馏水什么都可以了。

fengxuechunyang

路过，学习了！

皮搋子

回复 tangyvhuang 的帖子5 r: c2 K' {  V4 y% {; ?, Z" o" ~, ^) L
5 s9 g8 [: I5 b, Y
α萘酚磷酸钠 35mg+坚牢蓝RR 35mg 溶于35ml0.05M丙二醇，这个是什么染色法？( c4 j7 j, m& i3 K% O2 j3 Y
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我怎么找不到这个染色法？是碱性磷酸酶钙钴法染色法吗？

皮搋子

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$ l5 D. C0 Q. m' F$ L' V能提供一下钙茜素红染色法的配方和染色方法吗？