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本帖最后由 皮搋子 于 2011-2-20 11:13 编辑
$ e1 c9 j4 q8 T( {* \: f8 O
; o7 z3 k N9 U) V4 j转载一下noodleaf在一个帖子中的建议，供大家参考： 另外也问一下noodleaf，你那个配液方法貌似很难理解。。。请问配液是多少D/F12加上1nM 地塞米松. B以及其他的？看的人相当无解啊，本来非常详细的一个技术贴，因为这个原因，根本没法用。
8 r0 l% X- w* q
/ F" @0 `/ G' c$ Q* l8 O向成骨细胞诱导分化
& b# m" ?& I) ]$ M3 }* S0 F成骨细胞诱导液：
% a& w0 O/ n7 C' b. U; D) F/ XD/F12( 10%FBS)9 m0 ? U: t7 w( `
1nM 地塞米松. B
, D/ G* I2 O0 K5 Z0 C- D50 mM 维生素C
, y) v% Q6 }/ N' R10mM 甘油磷酸钠- P9 s& C' P& l# l# ^& ^
每3-4d换液1次，诱导至21d检测。
/ z+ E( u7 J# B! z' h' K2. 检测方法4 s* g3 V* T! W1 d. B
1) 光镜下观察：可见黑色不透明区域，肉眼可见白色结节时，进行染色检查；; o8 |* i: {* M5 I$ r8 \
2) 茜素红染色检测：染色2-3min。
. ] j, w+ F, `8 c* V3) 成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色：0 h% C9 h. S. k3 p9 E
3. 配液：
( [7 k, k+ Z# g1) 1uM 地塞米松3 B" b5 |% S Z. N
2) 50 mM 维生素C* [2 b' @& y; @" `( I
3) 10mM 甘油磷酸钠
. H9 g' a' Q$ T3 R- B4) 2%茜素红：取2g茜素红，溶于100ml95%乙醇溶液中，搅拌，与900ml 1% 氢氧化钾溶液相混。! K& | c) G( y# H6 Q9 | h. ^
0 R4 I' I, m9 C+ Y( @* {6 s向脂肪细胞诱导分化
8 n/ C. w% I2 F- `* m脂肪细胞诱导液：
( u( A) O/ c# Q! z# P& dD/F12( 10%FBS)
) ?- \3 Z- w; `1uM 地塞米松3 L$ L5 i4 K% B' |7 I
0.5mM IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）4 Q, [3 ^7 i1 t* B$ b
100ug/ml 消炎痛
* R m* n6 y+ s10ug/ml 胰岛素
- Y6 \. W G1 ]0 P4 w" c每3-4d换液1次，诱导至14d检测。
( ^4 R, L/ m- Q2. 检测方法：# ^2 v& e5 M, ~6 E
1) 光镜下观察：有成串的脂滴形成后（约10d），进行染色检查；+ y' P2 q' @: g* x2 f; K3 q3 F9 |
2) 油红O染色检测：染色30min。
) `* }) ]9 ?4 ~1 D. S) T9 C3. 配液：
! R% ~# H1 |1 u" U1) 0.5uM IBMX：) w5 D" W5 n( z
2) 100ug/ml 消炎痛：/ G. e8 B7 w1 ^0 i' R
3) 10ug/ml 胰岛素：) I" Q- a) L# k2 p9 B6 O: s) J
4) 油红O：油红干粉0.5g，溶于100ml异丙醇中，使用前以油红贮存液：去离子水＝3:2的比例稀释成工作液使用。& b/ T2 g2 d6 B7 h
1 T9 v) Z7 ~ l# ?& v# ^0 \
向软骨细胞诱导分化+ o4 `( K4 d- K) X
软骨细胞诱导液：
9 _" I8 {2 f, KD/F12( 5%FBS)
/ M5 p$ l! T" J) \, L+ S) S10 ng/ml TGF-β1" V. D P! p6 G, B
0.1uM 地塞米松
8 A% l; a- }2 D$ d0 E6 U. i50 mg 维生素C
( p- E- J6 f% G t& J+ I }& n+ O同时以未诱导MSCs作为对照。培养箱内进行培养，每3-4d 换液一次。诱导至21d后，进行相应检测。, `- x/ h, q5 B& L6 ?, h
2. 组织化学和免疫组织化学分析)
- ^- Y7 ~+ \: L' M F9 x" F, p1 m3 }" Y1) 显微镜观察：在倒置显微镜下，MSCs成软骨诱导分化后，细胞胞体变圆，胞质减少。
0 k2 d9 q/ z2 M/ w. j4 [2) 番红O染色：诱导分化14d后，移出培养基，生理盐水/PBS洗12孔板一次，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，1%番红O染色约3min，蒸馏水洗3次，95%乙醇洗3遍，光学显微镜下观察并采集图像。
# t( K P1 ?/ ]3) 甲苯胺兰染色：染色2-4h。6 x, f% b2 S+ f* K% ~
4) 阿利辛兰染色：染色' F& S7 y0 z7 S5 U
5) Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：' w) p" O& J c1 s- ^% {0 V1 `* Q; ?. @
3. 配液（1L）
2 t8 } m" z$ c5 s# m8 x5 {# W8 X1) 0.1uM 地塞米松：3.9*10-5g! p3 L2 W& Z# L& y7 ?9 Q2 x& L7 K
2) 50 uM 维生素C：8.8*10-3g) @' g' o9 ` V3 Q) b8 g6 v( b2 ?
3) 10 ng/ml TGF-β1：10ug/L
( A% G6 r8 ~) U8 X" t6 F# n4) 番红O配方：番红O 0.5g 95%酒精 50ml。% g, F" \+ `1 d. A! ?" K6 {4 s
5) 甲苯胺兰配方：甲苯胺兰 0.5g 0.1M PBS 50ml，调节pH7.2-7.4。
; u) _* C- P Y* V6) 阿新蓝染液(PH2.5)：阿新蓝(8G×)1.0g、3%醋酸100ml。调整ph为2.5。 |
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发表于 2011-2-20 11:07
发表于 2011-2-22 13:18
