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本帖最后由 皮搋子 于 2011-2-20 11:13 编辑
+ S6 T$ \* v" g; c4 h% U
* h9 F, x7 K1 D) e" i/ q转载一下noodleaf在一个帖子中的建议,供大家参考: 另外也问一下noodleaf,你那个配液方法貌似很难理解。。。请问配液是多少D/F12加上1nM 地塞米松. B以及其他的?看的人相当无解啊,本来非常详细的一个技术贴,因为这个原因,根本没法用。9 W0 z) j) t) ~
2 ?; b- w/ E- }+ n5 Y向成骨细胞诱导分化' D* r: ~1 T! d& Z T" r" v
成骨细胞诱导液:
& S0 f! S. V" ?6 E1 ]: [D/F12( 10%FBS)
1 Q; a9 \% u' j) P- c% e" a1nM 地塞米松. B
+ S" J$ T4 v9 B5 w+ A50 mM 维生素C
! G* ^0 Q& @# ?; |; Z' T10mM 甘油磷酸钠
. |+ H' c6 r( q# t& o每3-4d换液1次,诱导至21d检测。
, |/ ~. A& F% ^( g% g0 l2. 检测方法
$ a" M2 M: S2 @6 W0 z+ ^" f1) 光镜下观察:可见黑色不透明区域,肉眼可见白色结节时,进行染色检查;
( c) j1 W' F2 k/ A! ~2) 茜素红染色检测:染色2-3min。
! P! m+ d1 E% s! F7 |" X4 U2 `8 R3 X1 o3) 成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)钙钴法染色:
! t7 b- W& ]8 O& O' a1 [1 A- n3. 配液:
3 p2 S: q, ?+ S( O1) 1uM 地塞米松3 \# ~2 B. C3 g1 U7 U; t
2) 50 mM 维生素C
) a2 o' b2 k4 B8 b; C; [3) 10mM 甘油磷酸钠
6 m4 |5 I/ U6 m( }4) 2%茜素红:取2g茜素红,溶于100ml95%乙醇溶液中,搅拌,与900ml 1% 氢氧化钾溶液相混。
0 o4 l$ D2 g! L, {( l% i% l
' }# c2 r. V9 ]5 R1 L向脂肪细胞诱导分化
6 P/ B, M. j' u t脂肪细胞诱导液:
+ A7 _7 W3 N7 c% ?D/F12( 10%FBS)
; T* k# i% x# [. I0 i2 z# f1 B1uM 地塞米松
- g( E! t8 G$ p# n) W+ T7 z0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)
5 l) z! t t4 x$ \) S% b1 ]100ug/ml 消炎痛; g3 T. d8 S$ ^8 V. T
10ug/ml 胰岛素, c& A- W A0 H1 H" ~) {
每3-4d换液1次,诱导至14d检测。
; G- G% e4 S' Q& `2. 检测方法:" t: E K B5 j2 O$ j- n
1) 光镜下观察:有成串的脂滴形成后(约10d),进行染色检查;
" ~ B2 V% C* u/ O; X2) 油红O染色检测:染色30min。& A8 F/ I) F1 P* T3 K
3. 配液:
" j& o- B# w9 ^/ U9 U( F) `. D1) 0.5uM IBMX:: V( y4 {7 y6 n m
2) 100ug/ml 消炎痛:) u, W6 e! \9 m& U* G4 f
3) 10ug/ml 胰岛素:
. N4 k% `+ V% G- ]: w4) 油红O:油红干粉0.5g,溶于100ml异丙醇中,使用前以油红贮存液:去离子水=3:2的比例稀释成工作液使用。. c* p; d- n/ Q% M2 [3 z
8 A3 W' Y6 C; p h$ \4 p5 a* [) }, C
向软骨细胞诱导分化
9 K/ N$ P/ X/ S* K5 P0 x, S# g$ a软骨细胞诱导液:7 t& T6 N6 X+ Q! m
D/F12( 5%FBS)5 o* q6 z2 q+ ]/ |, f* u- ~ n* a
10 ng/ml TGF-β1
+ d8 u* ^! M4 J* k2 A* ~0.1uM 地塞米松
, C1 }6 n0 J- y2 j. Z. d/ l& k/ ]50 mg 维生素C' ~8 o9 ]) T) w. o# t: |
同时以未诱导MSCs作为对照。培养箱内进行培养,每3-4d 换液一次。诱导至21d后,进行相应检测。+ D2 c" r; w( B5 V+ Y* t8 v
2. 组织化学和免疫组织化学分析)
7 j! d w$ q* d" G/ ^& l1) 显微镜观察:在倒置显微镜下,MSCs成软骨诱导分化后,细胞胞体变圆,胞质减少。
8 D% D( x& v1 j& R2) 番红O染色:诱导分化14d后,移出培养基,生理盐水/PBS洗12孔板一次,4%多聚甲醛固定30min,PBS洗2次,1%番红O染色约3min,蒸馏水洗3次,95%乙醇洗3遍,光学显微镜下观察并采集图像。
1 I/ X+ L% W4 I7 k/ F3 ~# w; T6 ]3) 甲苯胺兰染色:染色2-4h。
, w! d2 x; F7 |) `: q1 K8 t p4) 阿利辛兰染色:染色7 |+ v& }' d9 ^1 E. V! C- M" N
5) Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:' N, Z( y0 @3 C0 k. k
3. 配液(1L)
# N; ^. Z( e- D, X1) 0.1uM 地塞米松:3.9*10-5g
2 n4 s% r0 N2 J1 X! {" H6 J2) 50 uM 维生素C:8.8*10-3g
: C$ ~( l/ m- _6 Y2 E- m3) 10 ng/ml TGF-β1:10ug/L
d& k0 w3 [/ d) Y: k& ^* E0 I' m4) 番红O配方:番红O 0.5g 95%酒精 50ml。
+ i* Y; \1 L8 R2 A/ J1 Q- {5) 甲苯胺兰配方:甲苯胺兰 0.5g 0.1M PBS 50ml,调节pH7.2-7.4。
3 {+ h) @' P4 z5 P6) 阿新蓝染液(PH2.5):阿新蓝(8G×)1.0g、3%醋酸100ml。调整ph为2.5。 |
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