绵羊脐带间充质干细胞，无文献摸索-Ⅱ 细胞诱导分化鉴定 - 间充质干细胞专区干细胞之家



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皮搋子

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11楼

发表于 2011-2-20 11:07 |只看该作者

本帖最后由皮搋子于 2011-2-20 11:13 编辑

转载一下noodleaf在一个帖子中的建议，供大家参考：另外也问一下noodleaf，你那个配液方法貌似很难理解。。。请问配液是多少D/F12加上1nM 地塞米松. B以及其他的？看的人相当无解啊，本来非常详细的一个技术贴，因为这个原因，根本没法用。

向成骨细胞诱导分化) ?& \% p9 B+ R7 O, h
成骨细胞诱导液：
D/F12( 10%FBS)
1nM 地塞米松. B
50 mM 维生素C
10mM 甘油磷酸钠' U2 j3 q5 \7 @8 o
每3-4d换液1次，诱导至21d检测。# T. Q& y2 z5 c- K( }* v. C/ N* {
2.       检测方法9 {* ~9 l; M: |( i9 K; ~% y
1)       光镜下观察：可见黑色不透明区域，肉眼可见白色结节时，进行染色检查；
2)       茜素红染色检测：染色2-3min。
3)       成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色：; r3 k- ~5 o, U- z% S
3.       配液：# @% J" i: i+ X9 B) }1 B
1)       1uM 地塞米松4 b" u% U, M9 ]6 J; F
2)       50 mM 维生素C
3)       10mM 甘油磷酸钠- F7 t4 T1 l/ ]( `# L
4)       2%茜素红：取2g茜素红，溶于100ml95%乙醇溶液中，搅拌，与900ml 1% 氢氧化钾溶液相混。: L4 k5 Y  p' S( J! S5 f6 ]0 d

向脂肪细胞诱导分化
脂肪细胞诱导液：    J, T9 r# p* D. r, _
D/F12( 10%FBS)
1uM 地塞米松
0.5mM  IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）
100ug/ml 消炎痛8 L5 H9 T$ i+ W* k$ z5 i
10ug/ml 胰岛素
每3-4d换液1次，诱导至14d检测。
2.       检测方法：  g- b, T8 \/ Y/ I
1)       光镜下观察：有成串的脂滴形成后（约10d），进行染色检查；
2)       油红O染色检测：染色30min。6 E' T* K) u- e9 p1 z
3.       配液：
1)       0.5uM  IBMX：
2)       100ug/ml 消炎痛：
3)       10ug/ml 胰岛素：1 [$ ?0 h1 ?( C+ o
4)       油红O：油红干粉0.5g，溶于100ml异丙醇中，使用前以油红贮存液：去离子水＝3:2的比例稀释成工作液使用。& o. _; V# W# L8 B: r8 l2 p, U
8 Q% y% y! h( [
向软骨细胞诱导分化, ~* s) O# B) \# N0 U4 l
软骨细胞诱导液：" M. E( E. `5 K/ W3 J3 l
D/F12( 5%FBS)
10 ng/ml TGF-β1* p  T) V. a6 `; w) P( B' ?( P  k/ }
0.1uM 地塞米松
50 mg 维生素C0 ]# X9 t  k& d" I5 `8 D
同时以未诱导MSCs作为对照。培养箱内进行培养，每3-4d 换液一次。诱导至21d后，进行相应检测。
2.       组织化学和免疫组织化学分析)
1)       显微镜观察：在倒置显微镜下，MSCs成软骨诱导分化后，细胞胞体变圆，胞质减少。
2)       番红O染色：诱导分化14d后，移出培养基，生理盐水/PBS洗12孔板一次，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，1%番红O染色约3min，蒸馏水洗3次，95%乙醇洗3遍，光学显微镜下观察并采集图像。
3)       甲苯胺兰染色：染色2-4h。4 S- w8 t8 Q3 {' R& f
4)       阿利辛兰染色：染色% Y" x/ ~  d# @# x- I$ G
5)       Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：
3.  配液（1L）
1)  0.1uM 地塞米松：3.9*10-5g
2)  50 uM 维生素C：8.8*10-3g
3)  10 ng/ml TGF-β1：10ug/L
4)  番红O配方：番红O  0.5g  95%酒精  50ml。! n8 s4 \5 @0 c' @
5)  甲苯胺兰配方：甲苯胺兰 0.5g 0.1M PBS  50ml，调节pH7.2-7.4。
6)  阿新蓝染液(PH2.5)：阿新蓝(8G×)1.0g、3%醋酸100ml。调整ph为2.5。