CIK的高效扩增技术

麒麟桃李

DC-CIK细胞的制备方法; b  ^: p. |) P! v( S4 K" {/ N
【背景】- y" r0 s2 I, ?- @" v
  CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
- f) N2 l1 a: gDC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
: X9 Q$ b% P2 u1 z, ^     DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。$ G- S! h) o3 a# b& N
【培养原理】
6 d6 }% J' w# Y2 }6 d- R1．DC培养用细胞因子：
- S7 `- o8 ^* ] GM-CSF( 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ) ：0 E- e. l6 R- ]) ~- @3 G( ^7 J
  GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
3 ?- C6 V4 H# a: z1 qIL-4 ( 白细胞介素- 4): M6 w* b- Z& c9 n) Q" x' N
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不表达CD14。
" K+ Z8 y* [" h, p! ^ TNF-( 肿瘤坏死因子- )
2 I/ Y+ I7 S" F, w& h4 Y! Q TNF-可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II    compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
# `5 f$ n& z( c2．CIK培养用细胞因子和抗体：  ' D/ y- y3 N& ]; {; p. f( A$ {9 D
CD3 激发型单抗：
% I6 L! \! g! M5 _: g2 PT细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸 (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。' O3 ~  s- i7 _4 r5 n( ^7 ?
IL-2 ( 白细胞介素- 2)+ [& ?+ S8 ?# C% w/ W  O: H
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
0 w; h+ Q" C. g- w: G  Y! ? IFN-( 干扰素 -)
$ b. V0 g+ I8 u+ Q  A. O$ [( Q IFN-;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。! E- X1 a  N% r$ h6 z
IL-1- (白细胞介素- 1) 　' P* @/ Y; {0 g' o
IL-1也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1与IFN-和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
. ?, `- f* m; D8 v【细胞制备】
& _; o% g' w3 \5 ^" C) D1． 外周血单个核细胞的采集+ ?) c0 Y8 ~6 D: W
       1.1      用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
( ^; X: L8 B. Z6 R0 l; h       1.2      淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
4 P/ J$ F; P, X% ?       1.3      无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。0 N" s4 |' T& n$ l( f
2．  ( 可选步骤) 肿瘤抗原的制备
- E+ r. i' b( H+ z. v3 E8 Z( _                用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
  I/ ~3 }; P$ O) O* [! q3 \         2.1      手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；& ]) n& }( E, w5 W* k
         2.2      无菌生理盐水洗3次；
9 W. P& U1 d, p. n         2.3      用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；5 j, P) q2 `; S3 D8 W. ~2 R
         2.4      200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
5 t  T0 X# }0 r+ m2 {' ?         2.5      用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；. o% J6 y) O1 A5 J9 y0 C. D9 N
         2.6      将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；( A' Q# ~) ~. L0 F: u8 R# Z) @0 ~
                   注：也可以 -80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。8 `3 n9 K. @4 F0 {, y2 o% a+ `7 G0 D
         2.7      将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
) D7 l0 |6 z* `: r& m1 ~/ t7 k- S         2.8      收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
" f; H+ A- Q1 w9 ]. o         2.9      -80oC保存备用。' H/ e" J3 E+ y2 n, r& N# y7 B) r+ K
. I8 M2 t9 n0 f/ q* k! I& @
3细胞的培养及鉴定
4 n- i2 ^2 ]& X         3.1      步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；6 @* ~$ h7 u& g& W/ l) d
         3.2      37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;6 Q- ]" ~7 Z# w5 w# B' O% Z
         3.3      收集悬浮细胞，． CIK用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；- j# G: i% y/ z1 ?% P/ o$ W3 X
         3.4      加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；
4 x6 b: ?0 K2 H' y; G         3.5      24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；+ C  s0 o, }8 r# S" ?  v* k
                     注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1  。1 ]" r/ `2 S* A% M# b4 k/ h
         3.6      每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；) e" N6 }6 P4 L8 g* y
         3.7      在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
- v: I) E  R" u! o: ^         3.8      CIK细胞质控：. M& W9 c* g1 _) ~
                  3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；/ ]/ L8 Z/ s4 n% Y5 v
                  3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
$ q$ c* E+ h0 I( [3 D' N                             显提高。6 A6 R8 o4 ]8 Y9 k  T; B& `2 L( z3 ]
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4． DC 细胞的培养及鉴定
  X4 [5 a' m( n& l* G# U; c          4.1      步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人- u" F2 r3 X3 x; b+ \5 f5 [- Y
                     IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；  C# B4 z7 M( e& A/ D
          4.2      每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；5 ?: n: w. j7 I: v* A
          4.3      (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
& k' O( r$ K- \( k+ L                      注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。; \: w. @5 h7 N$ D
          4.4      在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；/ F8 M3 h7 }- [. E
          4.5      在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；; J; f' r/ i$ @0 N9 F: R
          4.6      DC的质检：
5 ~% c. i3 H- d) b                  4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
& Q; Y. x6 N7 u0 W8 \                  4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。
8 H2 \- N+ J" Q3 b! N$ B. J ! n0 x7 m" C9 n3 t# h) j
5.     DC-CIK细胞的制备和质检- Z* N) k( W; ]" P& R
          5.1      收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添4 h& Z, ^. G! N4 o, b/ a7 d
                     加重组人IL-2 (300 U/ml)；
# w+ q& i) o# h: Y! _$ r          5.2      每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
" B& F. @5 }+ x7 F& d/ p2 e" V          5.3      在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
8 I6 S7 M$ B# }/ N- W/ x3 D          5.4      DC-CIK细胞的质检：6 D& V. i$ Q0 U( _1 W0 ]
                   5.4.1      台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
! ~/ ^5 u& J0 Y! s; o- l1 e1 S                   5.4.2      流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%' {1 M2 c0 c1 v3 @2 s! p( x0 b& A
                                  以上。
7 d$ }6 ?- }  v, s. v9 m* _$ r* ^                   5.4.3      细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
+ \& \2 Y% \5 X6 _, k) J1 \) U                                  细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 1042 u3 ~' ~& `1 v8 f( P# n) `
                                  个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
  v8 Y* s6 d, m8 J0 n                                  测效应细胞对靶细胞的杀伤率。1 @, }: R; _0 \7 s0 Y
                   5.4.4      收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病
5 H- m, a1 o% @. H: a                                  原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
) m. u) p) y/ p/ v【步骤简图】
3 r, I# M. j* u                      / K7 t* T9 j/ Q' d! g- h