RNAi荧光定量怪异结果

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平常经常要做RNAi实验，设计合成了靶点，然后用荧光定量PCR检测，问题来了，就算靶点没有干扰效率吧，也不至于会出现过表达的情况吧，但是经常遇到，有20-30%出现的概率，难道实验操作有问题？

jefferson

       楼主做的应该是相对定量吧6 }9 C. \: c5 p) U
    做qPCR对实验操作细节要求很高, 比如加样时Tip中的液体是否全部加入, 国产和进口Tip的挂壁产生不同孔间的差异等等, 这些需要在操作时十分注意. 同时从结果中也能反应出来, 分析结果时应将偏差较大的复孔剔除.
  c6 z* ?/ j+ P% E7 X' P9 c      根据所描述的情况,个人觉得最可能出在结果分析方法上. 目前主流的分析方法是△△CT法, 如果你用这种方法分析, 就有可能出现上述情况. 因为该方法的前提或者说默认条件是, 目的基因和参考基因的扩增效率相同且都是100%, 而在实际操作过程中,这点是很难达到的. 由于实际扩增效率不同,所以计算出来的结果可能就会偏差较大, 甚至出现你所碰到的干扰了还过表达的情况.
, p* g9 j# N, O6 y     严谨的分析方法可以用Pfaffl法, 这种方法需要通过标准曲线的斜率计算扩增效率,进而算出相对量的比值. 这就要求第一扩增曲线要比较好, 相关系统最好在0.99以上, 第二计算出来的扩增效率不能太高,一般95%-105%之间,有时你会发现会出现扩增效率200%的情况,可见单纯的用△△CT法是不准确的. 也有早期qPCR刚出现时发在Nature Science上的Paper中的数据,如果用这种方法分析, 那些结果都是错的. 而要做到相关系数0.99以上, 扩增效率合适是非常不容易的. 可能做十几次才能有几次可用的数据供统计分析. Pfaffl法的公式有点复杂,这里也没办法打出来,你搜下应该能搜到.* h  U, N9 {" d: u2 g7 P" a
      不过目前大家作qPCR基本都用△△CT法,所以我不知道有多少结果实际上是真的正确的,可能如果严格的去推敲,结果跟早期的Nature Science一样, 都是错的,呵呵
. s# U, o% g5 S' C& n' u    希望对你有帮助.

64627675

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非常非常感谢

qingbao

回复 64627675 的帖子. g0 e" T5 ^' i: e3 \
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RNAi实验中，设计的初衷是要抑制，但是出现刺激的情况也经常出现。主要可以解释为以下两个方面：其一，设计的siRNA特异性不够强，其实是基本没有干扰，再加上实验操作过程中的一些因素，可能会得到与抑制相反的结果。一般公认的能够说明一段靶基因真正得到抑制的效率是在70%以上，如果抑制效率在百分之五六十都不是很有说服力。你得到过表达结果的另一个原因：你这段基因有可能真的不是对靶基因产生抑制而是产生了刺激，我们都知道，RNA的调节也好抑制也好目前来说还有一些说不清楚的因素，一个碱基对的变化也有可能会得到相反的结果。这个时候其实是需要楼主特别小心的时候，没准就是会有重要发现出现的时候，以前我们发现的几个通路靶点就是这么得到的。
& t2 W" W' q$ v7 ~8 n" {其实，这种所谓的抑制和刺激的实验异常不光是在RNA干扰中存在，在最常规的小分子化合物筛选药物活性时也同样存在。比如在中枢神经系统的H1、H2、H3、H4靶点的活性筛选过程中也存在这样的现象，一个氢原子或者一个甲基或者一个卤素的微小变化都存在引起截然相反的结果。但是从目前所知道的化学机理也好、通路也好都还无法解释得通。这是题外话，只不过想说明，楼主的结果不奇怪，在排除siRNA序列以及操作平行性的基础上，没准会有意外发现和惊喜，需要留意。

qingbao

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qingbao 发表于 2011-3-6 15:45
8 s4 f  i4 E1 y( [1 }1 ?回复 64627675 的帖子
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7 _6 f' F; C* _1 y$ X  w& }. o3 a& X在这个帖子里，很想再补充说一点。不知道楼主做RNAi实验的目的是什么。5 x9 B- }) q% ~; D% p0 m% y
如果只是作为一种方法学，对靶基因敲除前后对通路或者说下游蛋白产生影响的话，那么追求非常高的干扰效率是正确的方向，我在前面说了，一般都要有超过70%的干扰效率，要不然会被质疑有很大可能的非特异性干扰。
: o1 Y) ^* q8 d' D如果楼主做RNAi实验是为了开发siRNA药物的话，就另当别论了，我在前面也讲过，往往处于抑制和促进临界点的那些似乎效率不太高的点倒是非常值得注意的。siRNA作为核酸，在作为药物开发的时候，其很多性质和小分子化合物有相通之处。我们知道其实在筛选药物的过程中，最后能成药的都不是活性最好的，siRNA其实也是。为什么呢，因为活性（干扰效率）和成药性其实就像太极的两级，最后要找的是两个性质的最佳平衡点，而不是单纯哪个性质最好的点。上面我所说到的中枢神经系统用药中，目前最好的药依然是组胺，为什么组胺好，是因为很温和，它其实只起到一个调节剂的作用。在复杂的人体系统中，在同样复杂的神经系统中，很多机理未知，很多反应是可逆的平衡，所以可能还真是温和的调节平衡的药是最后效果最好的，其实在对组胺结构做微小改动的过程中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂之间是没有明显界限的，这就好比RNAi中的抑制和促进在很多时候无法界定是一个道理。
1 ]: h# e. v' V: p7 Q在这里其实是RNAi的问题，但是我觉得问题和问题有时是相通的，生物药和化学药在很多方面是相通的，药物治疗和基因治疗也有相通之处，所以引入了小分子化合物的例子，希望楼主见谅。我还觉得，对于今后的干细胞治疗应该也是同样的道理，类似癌症这样的疾病，不可能全盘清除、连根拔起，走极端的道路，可能到后来最好的方法仍然要回归到调节的作用，调节什么呢？比如说就像大家特别关注的微环境，这只是我的一个简单想法，到此打住，不再离题了。以上都是个人见解，仅供参考，有不对的请指正。

ellapan

楼上几位非常细心 在此学习了