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楼主做的应该是相对定量吧+ f# `+ ?( g, ^3 ?
做qPCR对实验操作细节要求很高, 比如加样时Tip中的液体是否全部加入, 国产和进口Tip的挂壁产生不同孔间的差异等等, 这些需要在操作时十分注意. 同时从结果中也能反应出来, 分析结果时应将偏差较大的复孔剔除.
: D9 b, a! o2 p: b5 D 根据所描述的情况,个人觉得最可能出在结果分析方法上. 目前主流的分析方法是△△CT法, 如果你用这种方法分析, 就有可能出现上述情况. 因为该方法的前提或者说默认条件是, 目的基因和参考基因的扩增效率相同且都是100%, 而在实际操作过程中,这点是很难达到的. 由于实际扩增效率不同,所以计算出来的结果可能就会偏差较大, 甚至出现你所碰到的干扰了还过表达的情况.
' E" E. X7 I/ E3 l, i4 D 严谨的分析方法可以用Pfaffl法, 这种方法需要通过标准曲线的斜率计算扩增效率,进而算出相对量的比值. 这就要求第一扩增曲线要比较好, 相关系统最好在0.99以上, 第二计算出来的扩增效率不能太高,一般95%-105%之间,有时你会发现会出现扩增效率200%的情况,可见单纯的用△△CT法是不准确的. 也有早期qPCR刚出现时发在Nature Science上的Paper中的数据,如果用这种方法分析, 那些结果都是错的. 而要做到相关系数0.99以上, 扩增效率合适是非常不容易的. 可能做十几次才能有几次可用的数据供统计分析. Pfaffl法的公式有点复杂,这里也没办法打出来,你搜下应该能搜到.2 t8 G l! t" z4 o! [9 v# m" d
不过目前大家作qPCR基本都用△△CT法,所以我不知道有多少结果实际上是真的正确的,可能如果严格的去推敲,结果跟早期的Nature Science一样, 都是错的,呵呵$ ~; a& m8 O! v6 B& J
希望对你有帮助. |
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