为什么细胞没铺匀？

mbjane

我复苏的MEF细胞，将离心重悬的细胞悬液，加至10cm的培养皿的中间，十字方向摇晃了很多次，放入培养箱。) _2 E' h- ^, v, \! n
第二天镜下观察，细胞中间密集，其他区域较稀。且密集区域的贴壁细胞上吸附了较多死亡细胞。- w! n: m8 J6 d) v
请教高手，怎么会出现这样的情况呢？对于培养皿，铺板均匀的关键是将悬液按需要体积吹打均匀后，s线滴加吗？
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dxb1985

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铺板时最好不要来回晃动，要不然细胞都集中到中间了，用移液器吹打均匀即可
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hcluo

建议吹打均匀以后，放置2min左右，让细胞沉下来，此时不要摇动，然后就可以放回培养箱培养了，基本会均匀的。

hyde

我也刚开始学习如何养好细胞，师兄们教的也是说要十字晃动一下的，绕圈晃会因为向心力把细胞往中间聚集。吹打均匀的时候我会产生很多气泡，不知道如何处理……

jefferson

1, 重悬时要打匀, 防止存在部分细胞团, 那么铺皿后就会不均匀. 吹打时吸管头不要离开液面, 直接伸在悬液中吹打, 且每次不要将管子中的悬液全部打出, 这样就不会吹打出气泡.
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* o( A8 N# ?7 N( G2. 十字混匀时幅度不要过大, 否则细胞悬液会在皿内产生小的漩涡状运动, 细胞就会聚集在中间. # r+ L% @: I. X* n9 j& a8 s
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3. 混匀放到培养箱内后, 也要十字向混匀一两次, 因为在拿的过程中肯定不会水平, 可能就会造成细胞的分布不均,  这点比较重要.
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hyde

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" T4 N, l: q% [0 O/ M试试

hyde

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3 Y/ I! w4 p1 F- X传代后很多细胞没能贴壁死亡了，是不是因为传代时吹打太猛或者消化过度^

张也行

10cm板很容易晃匀，不用那么多下，只要保证细胞中间没有打转就行。

希望之光

呵呵 我原来也出现过这样的问题 我的具体做法是：先在培养皿低加上一毫升得培养液将底部溶湿，再在中间加上重悬的细胞，顺时针转四圈逆时针转四圈，然后前后左右各四圈，力度呢得看你怎么把握了，我一开始时会在镜子下看 知道找到合适得力度，现在铺的很匀

jefferson

hyde 发表于 2011-3-10 20:11
7 M: i4 z/ ^3 G# i5 P, h" I回复 jefferson 的帖子
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* ~$ N. E5 E# S传代后很多细胞没能贴壁死亡了，是不是因为传代时吹打太猛或者消化过度^

8 O; \7 A" n4 Y( x  U. E
是MEF吗?  z$ I# t) R+ {. ]: E

  ~0 n& \% i7 t; z) }MEF细胞还是比较好养的, 传代死细胞多一般不会是吹打造成的, 这个细胞没那么娇贵. 消化过度是可能的原因之一, 消化时最好摸索下胰酶的作用时间和用量, 一般最好要在两分钟内用最少的胰酶消化下来. 另外需要注意的是消化后用血清培基终止后, 最好离心弃上清, 然后再重悬接种.这样可以将消化时的胰酶去除干净, 避免对细胞生长造成影响.& L% b2 ?/ Z7 u+ X
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另外就是需要检查下其他因素, 如培养基是否正常有效, PH值是否已有明显变化, 细胞是否存在污染, 如支原体污染等