转染

ada800515

共转染pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有VSVG到293T细胞，及单独转染pMX-IRES-GFP-hNANOG到293T细胞，分别用fugene和lipo2000，荧光都没有几个，单独转染pMX-IRES-GFP-hNANOG时荧光数量稍微多点，但也不是很亮。用了一个阳性对照pmaxGFP产生满视野的荧光，是不是我的质粒中GFP不行啊？别的原因实在是分析不出来了，想请有经验的给分析一下。

大笨鸟

同样的问题。我单转pMX-IRES-GFP到293FT细胞，荧光不是很多，但强度比较弱。当与包装质粒（pSPAX2 和PMD2G）共转时，荧光就寥寥无几，有时甚至没有。还望高手指点。

ada800515

楼上的，是不是咱们这种质粒不好转啊？不知道群里这么多做ips成功的，有没有同样用这种质粒转染的啊？急切希望有用过这种质粒的介绍一下经验

ada800515

另外想知道大家转染效率高的，并且带GFP的，都是哪种质粒啊？同时用哪种细胞做的转染啊？

jefferson

ada800515 发表于 2011-3-11 11:00 8 j# Q. r( X9 {
共转染pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有VSVG到293T细胞，及单独转染pMX-IRES-GFP-hNANOG到293T细胞，分别用 ...

7 P: W# K) w1 d; O1 N6 E# g
1.转293

jefferson

ada800515 发表于 2011-3-11 11:00 8 P; C2 b. J% C) v  _
共转染pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有VSVG到293T细胞，及单独转染pMX-IRES-GFP-hNANOG到293T细胞，分别用 ...

: y& }3 V& x9 c0 E9 j1. 转293T细胞, 用Lipo2000要比Fugene6效率高3 F9 ]( G1 n1 b; \! ~
2. 单转一个质粒肯定要比共转几个质粒产生的荧光多. 所以你单转pMX-IRES-GFP-hNANOG时荧光相对多些.
6 V4 E# l+ ^( c9 o3. 你转pmaxGFP的对照效率很高,说明你的转染操作没问题. 另外这两个质粒的大小上,pMX-IRES-GFP-hNANOG基本大于对照的 pmaxGFP 1.5Kb左右,相对来说转染效率会低些,但不会差的太大.
+ B7 m, o+ |/ r; {5 F4. 一个很可能问题就出在质粒结构上. 不知道你用的质粒骨架是什么样的, 按照查到的一个结构图看, 你用作重组的pMX-IRES-GFP质粒和作为阳性对照的pmaxGFP质粒, 唯一的不同就在于重组的载体GFP前加了IRES序列. 那么也就是说, 转染细胞后, 两个质粒的翻译机制是不同的. pmaxGFP依赖5'帽结构和核糖体结合进而翻译GFP, 而pMX-IRES-GFP依赖IRES序列和核糖体结合翻译GFP, 一般来说, IRES的效率是相对低的,所以肯定pMX-IRES-GFP产生的GFP要弱于pmaxGFP. 但是这两个质粒在转录水平上应该是相同的. 7 \' ~5 c" R7 L3 ~
4. 以上是分析pMX-IRES-GFP和pmaxGFP的区别, 而对于你的pMX-IRES-GFP-hNANOG, 同样其转录水平应该是不受影响的, 而在翻译水平, GFR依赖IRES序列翻译, 而hNANOG依赖和pmaxGFP相同的5'帽结构翻译,所以理论上说, hNANOG的翻译表达水平应该和阳性对照的基本相同, 只是你的实验无法观测到.. ~# n. f0 s$ S& O* W. Q) g
5. 如果要检验是否真的是这个原因, 可以将pMX-IRES-GFP-hNANOG和对照的pmaxGFP转一个普通细胞系, 然后做Real-Time PCR检测转录水平是否无差异. 如果转录水平确实无差异,而GFP的荧光又弱,那基本就能确定是结构问题了.
' M7 u% `9 J7 C& J$ q6. 另外一个小的可能原因是, 你的两种质粒在抽提纯化时是否是同时操作的.因为我们之前发现, 质粒的抽提纯化方法, 包括有时同样的Kit用不同的批次, 抽出来的质粒其转染效率都是有差异的. 所以如果你作为对照, 最好保证质粒是同时纯化的.

ghfvcat

回复 jefferson 的帖子
. I4 Z/ j& ~9 s. T4 B* ~3 }# Q3 `
; ~6 ]# `# x- A% l# A. ~& e额，从我的实验来看，293T转染的时候，Fugene6的效率比Lipo2000要高出不少呢

jefferson

ghfvcat 发表于 2011-3-14 10:17 ! [8 L* o6 D# ?9 `6 S- B7 F
回复 jefferson 的帖子$ p( G2 Y1 D% ]" d( }. i2 M
, K& k3 i' U$ t" I$ |  b
额，从我的实验来看，293T转染的时候，Fugene6的效率比Lipo2000要高出不少呢

) X6 \: S0 P/ y& q+ V4 F6 `
我们在两株293T细胞里试过,都是Lipo2000要高于Fugene6, 用的是标准的转染方法,如Lipo2000中用OPTI-MEM等, 如果操作方法都一样, 那看来有的293T是不是更适合用Fugene6了

ada800515

用lipo2000转染时用opti-MEM与DMEM有啥区别吗

ambassador

ada800515 发表于 2011-3-11 11:00
8 c2 i) ^( v5 L: z共转染pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有VSVG到293T细胞，及单独转染pMX-IRES-GFP-hNANOG到293T细胞，分别用 ...

: y. h1 F, b" o6 j4 F我正准备做转染呢，听你们这么一说，都有点担心了。
& ?+ \7 h6 K1 c& \, @3 ]
% ^5 w5 @4 w) G( c- E请问：PMXS-IRES-Neo这个质粒适合再插入一个GFP进去不？