关于westernblot

future007

我想问一下，我要做一个17kDa的小分子蛋白，在WB实验中，转膜缓冲液是否需要加SDS和SDS在转膜缓冲液中的作用。谢谢

shewawa

这么小的蛋白质没做过，小于60kda的时候用的10%methanol的transfer buffer（tris-glycine+ ddw），Transfer 180mA 45min~2hr,我们的transfer buffer里面没有用过SDS，所以不太清楚效果。

jun8013

我也没记得有SDS

future007

谢谢你们得回答，我看了一些资料里，也都说小蛋白的时候不要加，但是没有给出答案，做了几次也没有什么结果，所以想看看时不时转膜液出了什么问题

张也行

8 a2 a) s: Y# `$ e) U6 e; p* D
7 i! N+ b+ q! `我觉得转膜缓冲液中SDS的作用是与蛋白质结合，使蛋白质带负电，加快转膜的速度吧。如果你的蛋白质只有17KD，最好还是不要加了，很容易转过的。

cjhpumc

我作过组蛋白的western，11KD和17KD
/ y  |% O/ z9 e7 b/ p* |转膜液用的是：
; w1 g0 k% Z+ [% r1 D) NTris(25mM) 3.03g + Gly(192mM) 14.4g +20 MeOH 200ml 加水定容至1L' Z# J, v& T6 N$ @" [8 r* b
转膜条件是350mA恒流，转膜时间不要超过50分钟4 u& e3 ?# i( N1 i7 ~6 t  d' s
效果挺好的，你可以试试

future007

cjhpumc 发表于 2011-3-16 10:30 ( f4 @  p( q, ^* ]+ z$ h( c
我作过组蛋白的western，11KD和17KD
* A, f4 \4 F3 |- m$ Y5 V转膜液用的是：
3 X8 ~% @( Y1 H! I! QTris(25mM) 3.03g + Gly(192mM) 14.4g +20 MeOH 200m ...

) ^7 ?% w0 K3 {请教你一下。11Kd和17Kd的具体的转膜时间，还有你用的是湿转还是半干呀？谢谢你的帮助。

splinkerette

Tris(25mM) 3.03g + Gly(192mM) 14.4g +20 MeOH 200ml 加水定容至1L
' S1 P5 o' r, ~我也是用的这个配方，湿转的，转膜buffer都没加过SDS。我们时间一般是100V 90min5 c' l* J0 ^. z9 u& n
那么小的蛋白，应该适当减少时间就可以了吧。。。

cjhpumc

回复 future007 的帖子
0 }9 g8 T6 z. Z/ g* k) F& g7 k; h1 V6 g6 m
湿转，bio-rad的机子，350mA，一般就转40－45分钟

weiyepan

回复 future007 的帖子, t# `9 ], m, `+ p4 p
2 o6 F( U% z; Q; p
17kD分子量很小,一般不用加.) U; C; H0 D/ D8 w- T
如果转膜没东西,可以试一下用丽春红染一下膜,用考马斯蓝染一下胶看有没有东西。1 e, M0 v8 Y  v2 d, z. k- W
如果确定胶上的已经转出去了，膜上没有，可能是跑出去了（尤其是PVDF容易穿），可以缩短点时间试试