关于westernblot

future007

我想问一下，我要做一个17kDa的小分子蛋白，在WB实验中，转膜缓冲液是否需要加SDS和SDS在转膜缓冲液中的作用。谢谢

shewawa

这么小的蛋白质没做过，小于60kda的时候用的10%methanol的transfer buffer（tris-glycine+ ddw），Transfer 180mA 45min~2hr,我们的transfer buffer里面没有用过SDS，所以不太清楚效果。

jun8013

我也没记得有SDS

future007

谢谢你们得回答，我看了一些资料里，也都说小蛋白的时候不要加，但是没有给出答案，做了几次也没有什么结果，所以想看看时不时转膜液出了什么问题

张也行

: r& o: S. _$ h' P: }- _
: p6 Q' O# }) t' q3 A) o; o' h) `我觉得转膜缓冲液中SDS的作用是与蛋白质结合，使蛋白质带负电，加快转膜的速度吧。如果你的蛋白质只有17KD，最好还是不要加了，很容易转过的。

cjhpumc

我作过组蛋白的western，11KD和17KD+ |6 x4 |7 s' ?- f) h' V' l
转膜液用的是：9 X9 |. X9 j* d- B9 k% }
Tris(25mM) 3.03g + Gly(192mM) 14.4g +20 MeOH 200ml 加水定容至1L
0 x: ~% W2 x) M% r1 V转膜条件是350mA恒流，转膜时间不要超过50分钟
# E  s: f+ ~6 _8 {效果挺好的，你可以试试

future007

cjhpumc 发表于 2011-3-16 10:30 ! O+ F* u  c, t" x1 M
我作过组蛋白的western，11KD和17KD, _; P- {& r) v/ W9 ~/ r: t4 d! @
转膜液用的是：4 |( x# y* b, S% W7 X, C9 M: p
Tris(25mM) 3.03g + Gly(192mM) 14.4g +20 MeOH 200m ...

1 \3 n+ A9 m5 D4 K  K4 x5 k
请教你一下。11Kd和17Kd的具体的转膜时间，还有你用的是湿转还是半干呀？谢谢你的帮助。

splinkerette

Tris(25mM) 3.03g + Gly(192mM) 14.4g +20 MeOH 200ml 加水定容至1L
4 H0 P/ v: I% X& B) Z) G我也是用的这个配方，湿转的，转膜buffer都没加过SDS。我们时间一般是100V 90min8 l1 M* m. [  y( B% c
那么小的蛋白，应该适当减少时间就可以了吧。。。

cjhpumc

回复 future007 的帖子( A3 p3 f  s' `/ W

8 T! e5 X# o, H3 j3 j, [湿转，bio-rad的机子，350mA，一般就转40－45分钟

weiyepan

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/ O$ @5 Y. L3 s$ G. l7 W* k1 u/ i' N: ]1 U: @* m
17kD分子量很小,一般不用加.
! `; u5 b9 x1 o如果转膜没东西,可以试一下用丽春红染一下膜,用考马斯蓝染一下胶看有没有东西。' p- u8 s& {  q* {6 l( P8 q& _
如果确定胶上的已经转出去了，膜上没有，可能是跑出去了（尤其是PVDF容易穿），可以缩短点时间试试