『求助』往ips细胞里转染质粒应该怎么做

stemcell8

现在如果得到ips细胞系后，可以在向ips细胞里面转染质粒么？这么做容易，还是先得到细胞系再做ips诱导容易呢？请大家给个意见 谢谢。

jefferson

向iPS细胞转染质粒当然是可以的, 现在很多研究就是这么做的, 转质粒的最好用电转. 不过还是用病毒转目的基因效率高些.
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先转质粒再诱导iPS我还没看到过报道, 主要问题是用于诱导的细胞基本都不是永生化细胞, 质粒转细胞后大多是瞬时表达, 即便通过筛选获得随机整合的细胞系可用于诱导, 这时的细胞已经老化了, 再诱导时效率就很低了.

stemcell8

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谢谢回复，我感觉也是可以的，但是没注意到相类似的文章，可以给篇文章么？如果没有电转和病毒用其他方法可不可以，比如说化学试剂什么的，和一般的细胞转染有什么区别么

jefferson

干细胞的基因转染相对成体细胞来说效率是比较低的, 一般能普遍用于成体细胞的非病毒方法,如磷酸钙,脂质体等, 转干细胞效率都非常低, 所以干细胞的转染用的最多的就是病毒, 非病毒方法就是电转,或者核转染. 至于用其他化学试剂转的我没看到过, 不好判断, 但推测应该很难达到比较高的效率. 8 l# q) S) v$ B7 g
搜的一篇论文, 用腺病毒转iPS的, 这个还是主流了. 没下到全文, 你求助下吧! v5 S' f3 S/ q( T- N
Adenovirus vector-mediated efficient transduction into human embryonic and induced pluripotent stem cells

suhangnba

回复 jefferson 的帖子& t4 I4 `, w9 {4 \- R. V+ J
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你好，我刚刚注册的新手，呵呵，看到你解答了好多问题，所以，有几个问题请教一下：我们使用蛋白诱导ips，老板想让我用质粒转染提高ips诱导效率，因为不了解这块儿，现在我所以无从下手，不知道是要把四个基因弄进一个新质粒里面，自己重新构建一个质粒转进去，还是有试剂盒之类的可以直接转染？ 谢谢啦！

jefferson

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有以下几种方法可以拿到你要用的质粒:
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1. 诱导用的质粒都可以在addgene网站上购买到, 大概60美元一个, 只是需要报关等, 手续非常繁琐. 如果有人在美国, 可以让他买了带回来是最好.; n/ Z" L" [) `8 \, B% M

" F) f4 k$ L1 {( g2. 联系国内做质粒诱导的单位, 看能否从他们那里要到一份. 中间可能需要签署转让协议等, 就看怎么协商了.+ L0 L, x* j: W( ~9 }* \

3 n9 R1 T: f; _3 |9 N3. 如果自己构建, 你可以参考这几年发的用质粒诱导iPS的文献中的方法. 第一篇做这个的是把OCT4, Klf4和Sox2 用2A序列连接后克隆入一个载体, c-Myc单独一个载体, 然后把这两个载体多次共转细胞获得iPS的. 关于2A序列可以参考我在另外一个帖子中的回复http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... p;page=1#pid310819. 我们之前试过不用2A序列, 只用IRES序列将四个基因分两组构建两个表达载体后共转诱导, 但未获得iPS. 所以如果你要自己构建, 还是建议按照文献中的方法构建.& k& }/ v4 o0 T

; S  `, [) g/ w! H9 M8 I' m' O4. 我理解你说的试剂盒是否是指包含了四种质粒, 按照说明混合然后转细胞诱导吗? 如果是这样, 目前我尚未发现有哪个公司有这样的产品, 实际上目前也不大可能有. 因为诱导用的质粒和方法不知道是否申请了专利, 要作为商业用途还是有点麻烦./ ^1 S$ a4 U+ v, s+ Z
) t# t) r3 _+ W% E: d& {5 ^1 p0 r
附首次报道用质粒诱导iPS的文献

suhangnba

回复 jefferson 的帖子, n" \7 w3 s4 ?/ y5 X# F

0 ]9 b; J$ z* b真详细，太感谢你了，那篇文献看过，感觉蛮复杂的，正好有个美国的熟人要回来，还是买好了，呵呵，我们平时说的质粒诱导ips和用质粒转染提高ips效率是一回事儿吗？  感觉后者中质粒就像是小分子一样的添加物。还有，买的质粒是买到后就可以直接加入细胞的吗？ 如果不麻烦的话，能不能告诉我该买哪几种啊？（这个最头痛）  刚接触这个实验，很多问题确实不懂，虚心求教，

winstonsee

有没有慢病毒的转染IPS的文献？或者方法可以参考

吃呆猫

IPS细胞你要free下来，然后用悬浮感染的方法，其实挺好转的