求助

ningtinglu

在利用载有4个Yamanaka factors 病毒载体诱导ips时， 可以联合2A pep-tide sequence and IRES technology减少ips细胞中病毒的整合位点以及插入突变位点。- z. g- w) m3 Z1 }8 ?
新手啥也不懂，哪位大虾可以帮忙解释一下2A pep-tide sequence and IRES technology以及可以减少ips细胞中病毒的整合位点以及插入突变位点的机制是什么？
! S6 G. Y5 C# G! F先谢谢各位大虾了:)

jun8013

IRES是不是非依赖IF翻译，2A为啥选2A 我只知道多A提高转染效率

ningtinglu

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谢谢 非依赖IF翻译是什么？不懂请多指教

jefferson

首先解释2A sequence, 其是来源于口蹄疫病毒的一段序列, 一般是由最少96个核苷酸编码. 2A的核苷酸序列翻译后, 可形成2A蛋白酶, 这种酶能够切割自身的N端, 所以当A基因和B基因中间以2A序列连接后构建入载体, 转细胞表达翻译后, 2A蛋白酶在其自身的N端切断, 于是A基因和B基因编码的蛋白就分开了,成为独立的完整蛋白发挥作用, 这就是2A序列.由于2A序列的这个特点, 其被引入到构建融合基因表达载体上来, 而且用2A序列可以精确的控制A B两个基因的表达量是相同的, 因为他们在转录水平上是一条mRNA链转录的, 只是翻译时被切断, 所以两个基因的mRNA量相同, 翻译出来的蛋白量也是一样的.
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鉴于2A序列的优势, 为了保证四因子能等量的在细胞内表达从而重编程细胞, 也用到了2A. 同时由于病毒感染细胞后是随机插入至细胞基因组中表达, 所以如果用四种单独的因子病毒感染细胞,必然随即插入位点比较多, 而且可能造成插入突变. 而将几种因子用2A序列连接起来构建入一个病毒载体中, 包装病毒后感染细胞, 其随机插入位点肯定比四种病毒的要少.而插入后诱导因子在细胞内转录同一条mRNA, 然后通过2A序列切割, 保证了等量同时表达, 从而起到重编程的作用.* T5 F7 i  H% ~- }2 E( K
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但是, 2A蛋白酶除了能够切割自身的N端外, 它还能切割eIF-4G蛋白,这是一种组成翻译起始复合物的蛋白, 该蛋白被切割后, mRNA 5'端依赖帽结构起始翻译的翻译起始复合物就无法形成, 因此mRNA就无法翻译. 所以2A序列使用时需要利用IRES结构, 即核糖体内部进入位点序列, IRES可以不依赖5'端帽结构而和核糖体结合,起始mRNA的翻译, 进而保证了2A蛋白的存在无法形成翻译起始复合物的时候,几个融合基因依然能够得以翻译表达的目的.' X% f: @+ x& N1 @4 `6 Q: G5 q

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ningtinglu

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3 D! r3 ~4 y7 U* |- b太感谢了，明白了

ningtinglu

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4 }- a9 v# D( A; K
! A! f; v/ P( t3 V) t我还想请教一个问题：如果我们使用慢病毒载体，2A蛋白酶也可以切割部分eIF-4G蛋白，那内源基因的启动翻译是不是会受到影响，从而使ips效率更低？

jefferson

ningtinglu 发表于 2011-3-20 14:51 + J0 f% A9 x, u2 ^
回复 jefferson 的帖子% [& X# I8 T5 V" }% j, R3 C5 G
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我还想请教一个问题：如果我们使用慢病毒载体，2A蛋白酶也可以切割部分eIF-4G蛋白， ...

& V, F4 c: d) q% Q  M4 d2 ^; D一般来说2A蛋白酶只会对翻译本身mRNA序列上的翻译起始复合物有影响, 因此基本只影响导入基因的表达.

ningtinglu

哦 这样啊 谢谢
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