关于插入多克隆位点的问题

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子6 N9 ~3 Z7 P9 y% Z/ Q5 L
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to 军医：) @/ E! z; G2 f* g+ L( f7 N

# z  L  E# Y# {2 |" [. S    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？
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$ q" u! n$ J! Y9 B/ }3 [* r+ I    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。
  m& I" b, G, X( S; c; ]! g! a& i  g, x  x; L2 X0 d+ R' b
    1. 你退火时的buffer是什么？
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/ L4 t, h% b- `/ t) D  v# A    2. 退火温度为什么选择72oC ？# @4 J: S+ o8 W  i2 I# e& I

8 g5 }+ M# ^4 Y1 _    这两个问题是你此次实验成功的关键。. t1 M3 [; s3 V2 H" X

* |6 z, v' [3 o! |     欢迎继续交流，共同进步。

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子6 y6 K4 c4 K, g. s$ x' Y  F
0 [7 e7 E, @+ n: A  w8 M& F" Z1 ^1 q
to 军医兄：% ~8 D. |- j' V$ s4 u
7 y$ h, V  T& F! A+ X
     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？# v, A- M) A. f

1 [" g& q/ C( \0 `+ u! u/ z! m     我个人的经验认为：4 M; C7 I. J7 {$ d" _
' u) i/ F, s1 l7 l! Z5 s8 P+ p
     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。
0 Z0 ~) q# [' R8 Q/ ~6 F+ w. P2 Z2 _
     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。, ]; B- ], r  p6 C7 S0 P1 w
; S, N: ^- K0 M; E
         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。7 P) D2 o$ I! a& `! c& X9 Y

& x& @( i& \& R; n- a         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。. w3 [3 T7 j  m
: N1 i. L  e; X7 r5 b+ Y& l
     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。
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/ ]5 |2 K9 c/ A+ l" V     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。
' x: r' Y  w, F9 c+ G! Q8 J0 i, |' C8 P  L

; B! ^' L: u3 X% Q7 P     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

深海寂寞鱼

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$ R4 e. e/ O! D呵呵  恭喜恭喜0 I" o& Q0 {$ e! [! E( r8 G, x
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静候佳音