关于插入多克隆位点的问题

军医

' \" v+ Q- B" v' L, w
" C: J  r. w/ f) Q% T* Z我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

深海寂寞鱼

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; d/ g) L7 P$ G! }8 V; @" h
, f) ~' w/ x) Mto 军医：
2 G1 `6 J/ q8 _# y, S- p; x+ Z' |* _* \- H- u4 r
    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？
' H% E9 m- K# f
* @0 Z& P1 f9 T( c! |" j6 @; ?    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。% a  {) K" {* J4 k
- r; Q3 v' ~* Q/ J
    1. 你退火时的buffer是什么？5 m# W% B3 }; P5 A; }
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    2. 退火温度为什么选择72oC ？" o4 V. T* Z$ f% p: @

' |  H/ D0 e- y! e- g5 R    这两个问题是你此次实验成功的关键。, w7 `3 z4 v# J' m

3 y' w0 ?" C% K  b     欢迎继续交流，共同进步。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子! l8 r+ o6 u" r% v! ~
" ~( m; M" E% K# q% ~# ?' h+ F: F
单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。
" J: O! \1 B! z( p9 w退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
$ ]3 U  L& d. j$ x' y. V另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子! m+ J! Q; L2 j0 V& Q: K0 }

- k- |! r& @3 h6 Rto 军医兄：. E# g# k  u4 ?6 }5 T" F% F
8 i' \& J. i7 D
     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？
9 ?9 N! C3 k9 ^, T; I& m/ t' w
! ~% ^$ }8 ?# H& n/ V( @     我个人的经验认为：' Z' J  M0 \0 s) d& M  s7 [3 Q4 j) H

  n  N; K& t( w1 x0 P7 e     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。8 b! Y0 L' R0 c8 J# o- p
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     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。  x+ i* j# o& z+ C7 ]0 ~
% z$ Q) L8 y0 }6 e  ^; _7 Q/ G
         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。
# M- P; k( \" D. D- v' w; |8 `' G8 S5 ]
         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。6 b& K, K% z1 ?( v& e- z
9 [$ A1 r* {- \3 z
     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。3 c# l8 O# K# D9 u. S
& {: b7 w+ ~( H  k* M% n, r
     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。' ^% R- m/ n$ m  _% ~4 a
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; i. s2 R6 r$ n; Y* i     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

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  ^& z! m% K- |! D1 T! ]) V# }8 v! V( m* f* `' A& H" H) _
谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

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  @+ D1 J  b) _& J( D& j  K: p& m% e8 Y- W
呵呵  恭喜恭喜
: q) t; J( E+ }8 D* y7 P* g: V; V$ K7 t+ ?2 L
静候佳音

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子2 V* N  Q  r" C  \& Y) u; g8 ?, y6 Y
/ ]( C+ f( q" v& e* X
8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子) W5 f, t+ j! J9 \; I1 e- X# A
3 G; S' g& a% N9 b2 T
我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
4 D6 n/ q: E: ?* C6 O6 YR:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
- q$ V  b* o# l+ X是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

a86856635

- e( o, v( i/ m2 C

+ f' a/ q7 K( R0 G7 |" ~应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。
& t  G- h/ \! |" q$ u' w6 o$ E你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低