关于插入多克隆位点的问题

军医

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我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

深海寂寞鱼

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0 f" p+ a0 D% L' j1 d( L5 c& r9 U9 ]  P: F! i. ?7 J
to 军医：. t$ v& R, Q5 {4 u$ m

$ D0 o8 u$ e" X0 f0 }; r/ k    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？
7 j1 P" P: `  s4 }; A) h% i0 w' C5 |& C  I- W! i
    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。
+ b* S* _8 w7 J) z
. p* u5 Q6 ?6 b% [( Y7 v    1. 你退火时的buffer是什么？
- N+ {: U9 l9 R0 C8 a# `3 n' a, u/ s5 e( q' z: v' N
    2. 退火温度为什么选择72oC ？. n% j, [; P$ D* C2 L0 r
8 t" G! b- Z1 j3 _% J
    这两个问题是你此次实验成功的关键。  E, o; w9 V0 L' G' z0 n+ ^

7 b; l+ Z! Z5 o( p' s! l     欢迎继续交流，共同进步。

军医

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. z4 v* H4 l& |8 c单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。
4 u2 r( y4 H5 x! c) D) B% `退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
. Q& Q( e7 q6 T6 X- x# v另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子+ O0 {+ r& v) O1 z0 q6 g7 O

2 K! Q+ C- K( [# r/ N& k( zto 军医兄：
( w7 t. ]8 Y6 [2 n6 B3 X  L
% S, P! X! q4 o; b     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？, S( ^" B7 Z* I9 ~1 l5 U8 Q
# P: p7 y% y- @) c/ a
     我个人的经验认为：
# e$ a+ S9 ~9 s; f4 g, G5 W) J% N* Z8 ~* P7 K9 {( f: o8 u
     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。
! P% h3 E; A: ~3 ^& A0 y; w' T0 S  I" i
     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。
; H/ i1 `, U: r3 ~' n9 Q4 ]# P/ P$ B3 h0 v* H! [
         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。' h1 |2 O( `- F% }6 |. g, @' J
# x+ z- f# @$ B' C( S
         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。
9 ]0 T! q3 y* {/ d$ ~( @  M
2 G/ u* p9 G! ~8 U& f& f/ @% V     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。4 D: P5 \5 N# O1 U- A

) J/ U, ?! e  L1 a0 a0 Z0 F     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。
3 ^9 A/ }9 U! I' b! H4 C) b
8 d1 k3 j$ c* G- b0 U8 [7 t
. c! K/ {6 s: Y1 b1 X8 U0 ~     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

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* e# Z) n4 D& t! ]; C, m; U4 B/ c9 ^2 f1 ]7 g! R. |! Q7 h# c
谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子9 w9 ~% ^& W4 H
* c8 b  N8 L. H4 E8 v1 m
呵呵  恭喜恭喜$ U0 a4 |% A5 {- w" C

  n8 l3 [5 S" F# j1 [7 N8 r$ {( Y/ L静候佳音

军医

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7 W) o: C! S) |! Y! q
4 g1 |: k( U6 \7 {  G8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

军医

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9 x& \( U4 z  R* Q
5 Z% z  v' I9 G! [3 ^我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
, N* u5 b/ O/ y$ l' Q% ~R:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
9 I" ^9 d  W+ ]$ \是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

a86856635

3 f$ P! k# k$ J. u5 t
$ b0 a5 L- S1 K1 Y& S
应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。' N- n: }: z$ t4 f0 N
你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低