关于插入多克隆位点的问题

军医

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$ ~. s# S% T$ g$ [& j, f4 R; H我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

深海寂寞鱼

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to 军医：
$ U% ?0 _, H. F" x: @2 f
$ C1 u: P2 d' c9 H- c4 @/ K/ J    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？7 Y' U( T% b9 o: Z4 y& [

$ D3 m7 X# U8 \1 U    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。$ O4 L3 G) @! T) o# P8 @% m2 M
9 a  z2 C3 G2 V# g2 u# R
    1. 你退火时的buffer是什么？
: ?+ P* r4 T3 G1 s1 |# g% K0 R" s8 I5 ?  a& `5 `
    2. 退火温度为什么选择72oC ？: `+ }! t' m  z2 W: j* n  M
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    这两个问题是你此次实验成功的关键。
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     欢迎继续交流，共同进步。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子8 R& l& V" W4 l/ Z( ~1 r& M  @& c
& Y2 Z) o2 `3 i, P1 q
单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。% L3 O$ _* f1 P
退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
! o7 K% {5 A4 ]另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？

深海寂寞鱼

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% Q& u8 ^; h5 r6 Y, s: w8 I
/ b0 [" _# o+ x' o3 Q1 g9 Xto 军医兄：8 Q3 h1 w, P( `! {8 V6 D
' k) |) _2 O: [8 C
     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？
3 z8 y; e6 S; B* P. H9 D) B9 t2 |$ G& C, M4 B
     我个人的经验认为：$ i1 Y6 C3 P9 |
& A1 @, C8 I/ |2 M
     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。* H- u: Q, i) E) C* f1 t

! e7 H8 V+ S  g+ S     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。
! `& o' ?7 E9 }9 ^
# y, h' p+ ?! s3 Z# J         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。$ Z' ^) K7 H' i' I3 S$ H
7 v" K; F* O3 ]
         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。
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5 C7 h. `' a3 z% z5 u; h. v     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。+ n: F9 z( m+ m/ K  D% [: O& d7 i$ A

" i4 q* b, Z+ L     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。
1 {9 U$ \& F: E$ I" N' W: c* Z8 m& o. Q$ z. b) M/ Z8 h7 D

( V4 O: e5 l0 B) _! P+ K; Y$ C! i; o( }     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子; g" m+ W  Q! t& d, Q9 E& H9 H. K

/ _" F; Q( G) I4 C: q, U/ T  t. a谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子3 L7 t" O3 f0 v, c5 h: K

  i" j; M& w& Z; r6 i呵呵  恭喜恭喜
, H  f+ w) z& B
' N0 B  Y" I# Q, G静候佳音

军医

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5 i. m7 Q1 P7 Q, V+ V4 y" \3 }! k' W" D
8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

军医

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1 u( C/ d( J  C
: ~( |+ Y- S$ O  q# Y: Z5 G: f' g我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
/ V" Y2 x+ Z- T: Q9 DR:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
; R: l3 ?0 W! }是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

a86856635

4 g7 X* [4 ]7 F! S! g$ K& {( h+ \! S, X( P+ ]$ U
应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。
2 }% s, B# s+ ^! b6 R/ P2 X5 ]你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低