求教：AP染色问题

amosummer

最近进行了一个克隆球染色技术。细胞长在96孔板内，严格按照说明，培养5天后进行染色。本来没孔已经长成7-8个克隆球了，但染完后发现这些球都不见了，细胞也很少，会不会是我们洗的时候操作有问题呢，把克隆球都给吸走了。有做过的同志们请告诉我如何改进实验，谢谢了！

ghfvcat

建议给出详细步骤，感觉克隆操作过程中应该看得见的，怎么会洗掉呢？

amosummer

1，吸取培养基4 z+ ~  s) J8 l# o. h# G: ^
2，加4%多聚甲醛固定1-2min;
( u# b% l0 z& a: }1 O3,  用rinse buffer 洗两次；) U0 x6 d8 V$ ?& [; I3 i
4，加入AP染色混合液，暗中室温培养15min;
  ~, R0 Z$ V, v& R4 h6 V# p5, 吸除染色液，用rinse buffer 洗两次
2 S( T3 ^  k' i6，加入PBS，显微镜下观察

ghfvcat

回复 amosummer 的帖子) i' @8 b# M9 c# Y

2 F4 N, i  S) [额，我做这个的时候没有用多聚甲醛固定，直接染的，为什么要固定？固定之后酶不是已经失活了么？其余步骤没有问题，应该是被你洗掉了，应该是你太粗暴了，要象对老婆一样温柔

amosummer

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& H6 Y8 j. `' x9 z2 Y( g% v$ O9 O; b9 y0 C
请问在96孔板内一般要养出多少个克隆才进行染色呢？是不是克隆太少的话不太容易染呢？

ghfvcat

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, K% n- i  R) @( e0 ~; q
0 L& h0 Q% W3 W2 A4 Y8 Y, X- z和克隆多少没有关系吧，一个克隆也能染的

amosummer

回复 ghfvcat 的帖子5 S9 m; W' c4 _5 K2 A( ~

( \8 V) g! {5 E4 E药品时间放久了对实验影响大不大呢？

ghfvcat

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. o3 t9 }9 `0 z) f& H/ n
$ Z$ O8 m* @) S额，你先告诉我你用的是什么试剂盒、0 V/ U8 W: x& x: K; r1 Y. u8 d4 [# f
药品有保质期的吧
, b* f- ?9 m& B( s2 X再说象这类化学底物，应该没那么容易坏+ q  A6 ^  ]) U6 w. J5 u6 `
我还是觉得疑惑，试剂盒的说明书要求先固定？  q9 L8 m& N, T" M
细胞固定基本上都是蛋白变性的过程，AP染色是为了检测碱性磷酸酶的活性吧？真的需要固定？

amosummer

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9 @' Q/ ~* q6 h; e" C- |: w/ L: i% z) o- l
是millipore的
$ r' r  E0 n" p- J* {- b1. Culture ES cells for five days prior to analyzing AP activity, at low to medium density (NOTE: This5 G1 g4 K) M+ Q( Y$ S3 c- ?" i
time-period is critical if activity levels of AP needs to be observed. According to our findings, five& Q9 x& L3 }0 _8 I! N
days of culturing are optimal for good AP stain visualization).: d/ [! K2 e6 s; x# _8 s
2. On day five, aspirate media and fix ES or EC cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde in" l3 S$ r3 B  h6 S
PBS) for 1-2 minutes.
) y0 ]! y* J9 l! B& l& Z& MNote: Do not overfix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline
7 I  U; y4 f, E# y- Dphosphatase.
# L! H! X  v) x' m3. Aspirate fixative and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry.
# t: d9 [4 Z2 i# A8 a
+ o5 q! K& @0 J6 P- P/ h4 v: h8 I5 t4. Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining as described in “Preparation of Reagents”section.* ^% m+ K, a9 Y3 D& ^! O' I- S
5. Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a% {! R$ x; J  g$ @" D
24-well plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes.
  @; g3 ~6 r; e3 W3 k# y6 F6. Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with 1 X PBS to$ h# \% }2 R7 H+ l; C6 I
prevent drying and then count the number of colonies expressing AP (red stem cell colonies),
9 e% [: ^* {" g/ x7 d$ A, ~versus the number of differentiated colonies (colorless).
( m6 _: @1 p2 A9 Q7. AP staining criteria: Greater than 90% of colonies should remain undifferentiated and express alkaline phosphatase in the well containing 103 Units of LIF. P value shall be ³ 0.05.

ghfvcat

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' P( K  K  ?% Q) f: U% Z' Q! g% K) ~  k* q
哦，说明书上要求的啊，那就固定吧，也蛮奇怪的，一两分钟的固定，不知道有什么深意。( T! e" x! r$ @/ ~  e" s& e
试剂盒肯定有保质期的，怕啥，没过期就行。6 w7 C( Y3 v: A! Q$ ?, G& K
吸的时候小心点，别戳到克隆，一般是不会掉的