求教：AP染色问题

amosummer

最近进行了一个克隆球染色技术。细胞长在96孔板内，严格按照说明，培养5天后进行染色。本来没孔已经长成7-8个克隆球了，但染完后发现这些球都不见了，细胞也很少，会不会是我们洗的时候操作有问题呢，把克隆球都给吸走了。有做过的同志们请告诉我如何改进实验，谢谢了！

ghfvcat

建议给出详细步骤，感觉克隆操作过程中应该看得见的，怎么会洗掉呢？

amosummer

1，吸取培养基: C4 y2 K( B+ @. ^9 F+ S2 R6 u
2，加4%多聚甲醛固定1-2min;
- }) B9 o- d7 T8 d3,  用rinse buffer 洗两次；
1 o7 n% ^0 n, C- d4，加入AP染色混合液，暗中室温培养15min;
- r4 v2 M1 Y7 K9 ?; \  A8 o+ \2 Y5, 吸除染色液，用rinse buffer 洗两次
4 T- v. B4 S) G. Q6，加入PBS，显微镜下观察

ghfvcat

回复 amosummer 的帖子4 ?; T2 ?* B; w- x8 w* I) u

- O% J9 H: |; ]' I: M0 ^0 I额，我做这个的时候没有用多聚甲醛固定，直接染的，为什么要固定？固定之后酶不是已经失活了么？其余步骤没有问题，应该是被你洗掉了，应该是你太粗暴了，要象对老婆一样温柔

amosummer

回复 ghfvcat 的帖子0 h) a/ R0 u6 e+ }0 a

8 P& q% `4 ]( v* E, m$ G: p2 @请问在96孔板内一般要养出多少个克隆才进行染色呢？是不是克隆太少的话不太容易染呢？

ghfvcat

回复 amosummer 的帖子3 \& S2 ~9 F/ @) y+ w0 i

, _7 G+ d* C( F  s. B. \+ U* H+ G和克隆多少没有关系吧，一个克隆也能染的

amosummer

回复 ghfvcat 的帖子7 S& L  {6 @7 c

2 H* J7 E7 L1 V% p) m$ F药品时间放久了对实验影响大不大呢？

ghfvcat

回复 amosummer 的帖子# h6 |& U1 }, M0 q1 y5 ~$ S
# I$ J: ]% t% J4 A" s* d
额，你先告诉我你用的是什么试剂盒、
* k' u2 \) I: a! W* K药品有保质期的吧( h' C1 R3 o0 P' H  r, A9 n
再说象这类化学底物，应该没那么容易坏5 B3 u4 ]3 L. Q; b2 Z/ }% S
我还是觉得疑惑，试剂盒的说明书要求先固定？
, C% x6 x7 q& S1 K$ a# q& |' i细胞固定基本上都是蛋白变性的过程，AP染色是为了检测碱性磷酸酶的活性吧？真的需要固定？

amosummer

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3 C4 m0 H3 ]5 O# k7 U' e
- C9 f1 I9 L& `; B# y& y是millipore的0 n* u1 F% w5 y* U
1. Culture ES cells for five days prior to analyzing AP activity, at low to medium density (NOTE: This0 D& ^& Y5 S3 |: F* G
time-period is critical if activity levels of AP needs to be observed. According to our findings, five) I; x+ h% d2 q9 c& \) T0 n% j( k
days of culturing are optimal for good AP stain visualization).  p9 ?3 [& x' o" T
2. On day five, aspirate media and fix ES or EC cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde in, t  o5 A) `* b5 C$ A' t+ o) G
PBS) for 1-2 minutes.' ~* b* |7 x$ [
Note: Do not overfix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline# q% [! o. e1 ~7 w
phosphatase.% _0 r! T3 _' B; a* P1 G
3. Aspirate fixative and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry.% |( B+ ^" V) Y3 o$ @" x, @

: ~5 J+ _3 j4 J) g9 }( |4. Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining as described in “Preparation of Reagents”section.1 d8 j& T4 w( Y" ]5 j
5. Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a
/ [% h- h9 m4 k5 E2 l24-well plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes.7 s9 X$ z+ @. r' v* R4 t5 ^* o( v
6. Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with 1 X PBS to
' h, k. E; B5 y" `  [! Hprevent drying and then count the number of colonies expressing AP (red stem cell colonies),
+ y' M9 A7 i7 M! s7 l6 Oversus the number of differentiated colonies (colorless).6 _" ?, O7 d: M$ |, W; O
7. AP staining criteria: Greater than 90% of colonies should remain undifferentiated and express alkaline phosphatase in the well containing 103 Units of LIF. P value shall be ³ 0.05.

ghfvcat

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' R5 A/ e4 k5 ~  K* j* M) s- S8 n
, M7 d4 |3 I9 ?/ w. y' ^0 b哦，说明书上要求的啊，那就固定吧，也蛮奇怪的，一两分钟的固定，不知道有什么深意。
+ Q* N, k: K, I1 w7 _试剂盒肯定有保质期的，怕啥，没过期就行。7 \, @4 x/ }2 x# ^8 ?& C
吸的时候小心点，别戳到克隆，一般是不会掉的