小鼠骨髓间充质干细胞

clairezy1983

我养小鼠骨髓干细胞有一段时间了，建议用骨片法，建议用STEMCELL公司专门的培养基，小鼠的MSC形态就是不像人的那么好，我把我自己整理的实验方法发给你，希望能给你参考。9 c' C" u( T) k0 ]6 d: E
原代MSC培养
9 B  Q& p: {( K" U1.        断髓法安乐死处死老鼠（4-5周龄，雄性BALB/c鼠），在酒精中消毒5分钟，无菌取出后腿，去除韧带和多余的组织，从踝关节和髋关节处分离出股骨和胫骨，置于加双抗的D-hanks液中。
( }  {- H0 n  E7 y% g. U2.        用剪刀和镊子彻底地去除肌肉，切除骺端。确保骨头上无附着肌肉。. j4 T8 k+ k% O" p
3.        将骨头放置在10ml缓冲液中，Buffer: PBS+2%FBS+1mM EDTA。
/ A6 v# w2 r5 b5 W4.        用注射器尾部圆饼摁压骨头，力度要轻，使骨头裂开即可，轻微搅拌使骨髓从骨片中释出，用移液管吸出缓冲液。
  ?* K4 ?- b$ J% M3 G* k5.        加10ml新鲜缓冲液重新搅拌洗涤，去除骨髓，重复5次，直至骨头洗白，大部分骨髓被除去。' \/ W' R: |  S6 u; J
6.        去除缓冲液，加入2ml 胶原酶I溶液（0.25% 胶原酶I + 20% FBS + PBS），预消化3-5分钟，使骨髓软化，容易切碎。5 w! j8 |% F0 S5 e. B0 ~4 C3 J. \6 W
7.        用剪刀剪碎至1-2mm，以保证释放足够细胞量。
0 l# Z) e# d8 Y0 d4 x" N3 _8.        将碎屑放入50ml离心管中，加入胶原酶I溶液至总体积10ml, 或者2ml/鼠，加封口膜，将离心管放置在37℃摇床恒温槽中最大速度消化45分钟。摇床的速度设置为200rpm。
& y5 e) j/ Z# v! h' m# |: V5 [% T9.        加入缓冲液到总体积30ml，1200rpm，室温离心10分钟，制动打开。用MSC培养基将细胞重悬浮，接种于T75，骨片也一同接种于培养瓶中，让其均匀铺开。置于孵箱孵育。0 O) q. d- s4 [" _

clairezy1983

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- j- _+ |& \5 l) b& }2 X: D: ^0 @+ L9 g. b
小鼠的MSC形态跟人的没法比，人的MSC形态比较规则，看起来挺整齐，小鼠的MSC样子挺丑的。我已经很长时间不养小鼠的MSC了，现在主要做人的。7 l3 T9 \  H8 G6 {" p: D
你用骨片法的时候要把骨片一起种到培养瓶里，放入孵箱之前，摇晃均匀，最好三天都不要动它，可能要更长时间细胞才能长满，然后你会发现从骨片周围爬出很多比较整齐的MSC，有的时候呈放射状。你要是总是不同的观察，骨片就飘走了，不利于细胞的爬出。* M9 q& \: `* ~/ c4 o% Q) g
他们公司的protocal里面说的还要过滤，这一步也是省略的，因为要直接把骨片弄进去的嘛。
9 I7 ?1 V9 p; z8 O+ e. `/ W# B- ]还有碾磨的时候一定要动作轻柔，垂直用力，而且要轻，只要把骨腔打开，让血液出来就好，千万不能左右摩擦。
6 n4 y+ y, X1 A2 L' G( ~5 u碾磨之后冲洗的时候也得温柔点，我有一次就是冲洗过度，洗得很白净，但是干细胞也没有，那些红红的血水去掉就好了哈。3 o/ `) e) H1 U5 r% ?& v6 B5 ?1 Q
传代培养的时候密度最好大一点，还有不能消化过度，很多消化不下来的细胞根本就不是MSC哈。据我的经验，MSC很好消化。$ z7 n- A, {  M7 j1 l
暂时就想到了这么些，希望对你有所帮助。

clairezy1983

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( r2 v- S/ _! X2 T: t- S( C
+ X) f4 G. C8 `* G恩，你试着降低胰酶浓度，和消化时间，不要期望把所有细胞都吹下来，很多细胞消化不下来的都不是MSC哦。

clairezy1983

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  F# S& c# w) ]9 @0 u# l4 B& K  u( }2 K5 ~  h( F" S7 I$ L6 o4 [& l- T
浓度有点大，降，大胆的降哈

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子% b! w: ^/ v) Y! l0 G$ g

, y- F% x9 ]& `7 O) Z" E0 M我现在都是做人的脂肪来源的MSC，没有做鼠的呢。我是做成脂成骨诱导。

clairezy1983

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* B  i, S: f( S7 N+ g# |8 D+ M0 F/ O! F! c, X
不会，培养基没有适合成骨分化的条件啊，骨细胞更不会吧，我觉得那些干细胞应该是从骨膜上爬出来的