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我养小鼠骨髓干细胞有一段时间了,建议用骨片法,建议用STEMCELL公司专门的培养基,小鼠的MSC形态就是不像人的那么好,我把我自己整理的实验方法发给你,希望能给你参考。5 O$ D# L. R0 {
原代MSC培养& R6 a* [; ] _2 k; Y7 |
1. 断髓法安乐死处死老鼠(4-5周龄,雄性BALB/c鼠),在酒精中消毒5分钟,无菌取出后腿,去除韧带和多余的组织,从踝关节和髋关节处分离出股骨和胫骨,置于加双抗的D-hanks液中。+ v' Y- N s+ z X7 w* f8 }
2. 用剪刀和镊子彻底地去除肌肉,切除骺端。确保骨头上无附着肌肉。. L$ g0 h( K3 }. L& s
3. 将骨头放置在10ml缓冲液中,Buffer: PBS+2%FBS+1mM EDTA。5 G$ ^( ~% v* ]# P! A" _
4. 用注射器尾部圆饼摁压骨头,力度要轻,使骨头裂开即可,轻微搅拌使骨髓从骨片中释出,用移液管吸出缓冲液。
6 e8 Q5 P0 b t% \! a5. 加10ml新鲜缓冲液重新搅拌洗涤,去除骨髓,重复5次,直至骨头洗白,大部分骨髓被除去。8 T* u4 U |7 X# g& c
6. 去除缓冲液,加入2ml 胶原酶I溶液(0.25% 胶原酶I + 20% FBS + PBS),预消化3-5分钟,使骨髓软化,容易切碎。
! N3 n# |8 r3 \! a$ S" y: u5 F( |7. 用剪刀剪碎至1-2mm,以保证释放足够细胞量。" e4 `) q, n; O6 I1 x& Y
8. 将碎屑放入50ml离心管中,加入胶原酶I溶液至总体积10ml, 或者2ml/鼠,加封口膜,将离心管放置在37℃摇床恒温槽中最大速度消化45分钟。摇床的速度设置为200rpm。" w3 _9 r7 O. e. w9 @, J
9. 加入缓冲液到总体积30ml,1200rpm,室温离心10分钟,制动打开。用MSC培养基将细胞重悬浮,接种于T75,骨片也一同接种于培养瓶中,让其均匀铺开。置于孵箱孵育。6 R, c- R5 W2 t7 H t% O7 ]
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