小鼠骨髓间充质干细胞

clairezy1983

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* a2 R, R' Y+ U0 f! E& [( J7 A9 K& R8 C9 w; B) U
小鼠的MSC形态跟人的没法比，人的MSC形态比较规则，看起来挺整齐，小鼠的MSC样子挺丑的。我已经很长时间不养小鼠的MSC了，现在主要做人的。
0 i9 n7 b# t6 j; I你用骨片法的时候要把骨片一起种到培养瓶里，放入孵箱之前，摇晃均匀，最好三天都不要动它，可能要更长时间细胞才能长满，然后你会发现从骨片周围爬出很多比较整齐的MSC，有的时候呈放射状。你要是总是不同的观察，骨片就飘走了，不利于细胞的爬出。8 ?: b  |  |9 Y
他们公司的protocal里面说的还要过滤，这一步也是省略的，因为要直接把骨片弄进去的嘛。6 Z( u1 u. f$ [/ q) K' ]$ H+ v
还有碾磨的时候一定要动作轻柔，垂直用力，而且要轻，只要把骨腔打开，让血液出来就好，千万不能左右摩擦。
8 F  ~7 d# G% f6 U( `; s碾磨之后冲洗的时候也得温柔点，我有一次就是冲洗过度，洗得很白净，但是干细胞也没有，那些红红的血水去掉就好了哈。
) k6 z: |$ n. l& Z9 t传代培养的时候密度最好大一点，还有不能消化过度，很多消化不下来的细胞根本就不是MSC哈。据我的经验，MSC很好消化。, w2 a% M0 j0 l/ }/ r
暂时就想到了这么些，希望对你有所帮助。

liuxiao2006

我用的是DMEM/F12的培养基加上进口胎牛血清（10%），细胞长势很好啊。可能与细胞株有关吧，我用的是纯化过的细胞株，大概3天就要传一代

bianhuimou

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, J( O/ b2 M# b4 }
2 N9 e0 S1 K0 s是的，骨片法原代法可以看到放射状爬出的MSCs,可是传代后细胞形态变化的很丑，乱糟糟的。

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子4 k8 y8 g% }- |  s; Q

, ^* i; X* A" a1 P恩，你试着降低胰酶浓度，和消化时间，不要期望把所有细胞都吹下来，很多细胞消化不下来的都不是MSC哦。

bianhuimou

恩，胰酶浓度0.25%，消化两分钟，我之前养出来一瓶可是之后就再也养不出来了。

clairezy1983

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! k, X: e+ ]% `3 c
8 R3 x& s8 K; v/ V9 M浓度有点大，降，大胆的降哈

bianhuimou

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% s6 T5 A7 L3 s" T. G/ \9 M3 ^8 O# u% @0 ]: h
大胆的降！哦，我试试，这个细胞太难养了

bianhuimou

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' j; X; [; w9 J/ @2 ]! d( p
9 Y* D/ c) Z) M. w+ b我最近进行诱导分化可是总是不成功，您有经验传授一下吗？

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子: H; h/ D  ?3 H

* x" p5 {' e" X  R, }我现在都是做人的脂肪来源的MSC，没有做鼠的呢。我是做成脂成骨诱导。

viv2005

我做rat的，小鼠的没做过，不知道我的protocol有参考价值没，感觉MSC是最好培养的了，比什么osteoblast和osteoclast好养多了7 e4 l  ]! Q; o

8 X' t9 m7 s1 |# UMSC  Isolation from Rat Femur and Tibia4 H( ]3 `) j$ C
1.        Euthanize the rats with CO2 for 5 mins.
9 s& Y/ ^, ^/ ]2.        Isolate femur and tibia by disconnecting them at the joints.  x3 S& J4 c- T7 e( j1 _2 ^9 ^
3.        Clean the bones of soft tissues.& |/ n, n& @; l* b! [& s  G/ C
4.        Wash both femur and tibia in PBS containing 1% penicillin/streptomycin twice.
- c6 r6 |2 K2 Q+ B) c! Q3 C5.        Under the cell culture hood, clip-off the epiphyseal plates to expose the bone marrow.
& Y/ X, _1 y! W4 l( N3 \6.        Using a syringe, flush the bone marrow with 10 ml of media into a dish.5 d/ a$ ~) J2 r1 m* w
7.        Break up the clumps by aspirating the cell solution multiple times.
% E( A( n1 c" j+ s. S3 t8.        Using a 70μm cell strainer, filter the cell solution into 15ml tube. This will remove any unwanted debris and bone fragments.) M) Q1 B& g: j' ]
9.        Centrifuge the filtered cell solution at 1000rpm for 10 min.2 C0 k% k! ~7 T) U  V7 [1 \- S
10.        Resuspend the pellet and pipet this solution into a 100mm dish.% X1 M$ w* z! Y! f
11.        Incubate for the next 48h.
. `9 l+ K8 U, X) ^) ^* O7 L12.        Change media to remove non-adhering cells.
7 V2 O" B: D: i8 ~  I2 \# s2 v13.        Change media every 2-3 days, even the media doesn’t change the color.
+ }# a4 J3 _- ?; _' O14.        Usually the cell will be confluence at 7-10 days, and then are ready for passaging.; M' F" h) h& R9 R. ?' T8 o/ X( {