小鼠骨髓间充质干细胞

clairezy1983

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% d% z; i" V' U  m2 ]  `
3 S' }+ d% z* X小鼠的MSC形态跟人的没法比，人的MSC形态比较规则，看起来挺整齐，小鼠的MSC样子挺丑的。我已经很长时间不养小鼠的MSC了，现在主要做人的。
0 |3 A4 a, z; f! j+ O, F; Y你用骨片法的时候要把骨片一起种到培养瓶里，放入孵箱之前，摇晃均匀，最好三天都不要动它，可能要更长时间细胞才能长满，然后你会发现从骨片周围爬出很多比较整齐的MSC，有的时候呈放射状。你要是总是不同的观察，骨片就飘走了，不利于细胞的爬出。
* }! L" J3 S( C- e他们公司的protocal里面说的还要过滤，这一步也是省略的，因为要直接把骨片弄进去的嘛。& H6 W" t6 |3 h2 N9 C
还有碾磨的时候一定要动作轻柔，垂直用力，而且要轻，只要把骨腔打开，让血液出来就好，千万不能左右摩擦。
3 J. F$ D" ]/ S* Y( m9 q" S# N碾磨之后冲洗的时候也得温柔点，我有一次就是冲洗过度，洗得很白净，但是干细胞也没有，那些红红的血水去掉就好了哈。
8 ]4 ^7 E2 t& L传代培养的时候密度最好大一点，还有不能消化过度，很多消化不下来的细胞根本就不是MSC哈。据我的经验，MSC很好消化。+ O4 j9 B6 _9 G! N5 J8 T
暂时就想到了这么些，希望对你有所帮助。

liuxiao2006

我用的是DMEM/F12的培养基加上进口胎牛血清（10%），细胞长势很好啊。可能与细胞株有关吧，我用的是纯化过的细胞株，大概3天就要传一代

bianhuimou

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1 i8 T% ^9 F/ I6 r7 o. k2 h, a' n$ Z& D! {  ^
是的，骨片法原代法可以看到放射状爬出的MSCs,可是传代后细胞形态变化的很丑，乱糟糟的。

clairezy1983

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5 q) o% p# O  t& l
8 y& c: d0 b4 y1 p4 n+ r+ X5 u+ Y恩，你试着降低胰酶浓度，和消化时间，不要期望把所有细胞都吹下来，很多细胞消化不下来的都不是MSC哦。

bianhuimou

恩，胰酶浓度0.25%，消化两分钟，我之前养出来一瓶可是之后就再也养不出来了。

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子4 V2 \4 S2 w: g) f

* Q8 [( Z0 r' y浓度有点大，降，大胆的降哈

bianhuimou

回复 clairezy1983 的帖子7 b8 [4 c. |% n) g
# T* v& R7 O6 a. }' A( R
大胆的降！哦，我试试，这个细胞太难养了

bianhuimou

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9 u7 U* G0 |- l; ]9 Q2 M$ E8 ]
% f3 a1 n: _5 U0 {& n& Q0 c7 n我最近进行诱导分化可是总是不成功，您有经验传授一下吗？

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子+ y: S  C5 M: n, [; A- g3 T4 t

. u: C3 i0 t7 e我现在都是做人的脂肪来源的MSC，没有做鼠的呢。我是做成脂成骨诱导。

viv2005

我做rat的，小鼠的没做过，不知道我的protocol有参考价值没，感觉MSC是最好培养的了，比什么osteoblast和osteoclast好养多了
: G3 d! v  Y( i0 C, F7 y) j+ p  c7 P4 D1 V+ f8 ]
MSC  Isolation from Rat Femur and Tibia
  [1 `4 F+ F4 u1.        Euthanize the rats with CO2 for 5 mins., s; v( C* P  Q
2.        Isolate femur and tibia by disconnecting them at the joints.
! A. _3 {4 I( y+ l5 X! t! ^) |! M9 z3.        Clean the bones of soft tissues.
( h; L5 Z1 s+ G2 X5 c. K9 T4.        Wash both femur and tibia in PBS containing 1% penicillin/streptomycin twice.
7 m! z$ k9 ?( u" o# F5.        Under the cell culture hood, clip-off the epiphyseal plates to expose the bone marrow.
8 {9 e% j& G6 E  U! f+ J6.        Using a syringe, flush the bone marrow with 10 ml of media into a dish.
, Q& x, g0 D/ I/ L5 m7.        Break up the clumps by aspirating the cell solution multiple times.
; l9 D9 D# L6 ~  O3 u) f! }8.        Using a 70μm cell strainer, filter the cell solution into 15ml tube. This will remove any unwanted debris and bone fragments.
& ~# e! |6 ~* `* }$ h: c9.        Centrifuge the filtered cell solution at 1000rpm for 10 min.
& H. I) U7 O' T10.        Resuspend the pellet and pipet this solution into a 100mm dish.
7 z! |  @; L. n# h' h" Y% b& y0 k0 v11.        Incubate for the next 48h.
, Y% E1 T4 e" m% i. ]" H12.        Change media to remove non-adhering cells.6 ]/ J* q, m  c! ~
13.        Change media every 2-3 days, even the media doesn’t change the color.% g- b& r5 l+ E( G& u  C
14.        Usually the cell will be confluence at 7-10 days, and then are ready for passaging.( H# m& z5 O, K