小鼠骨髓间充质干细胞

clairezy1983

我养小鼠骨髓干细胞有一段时间了，建议用骨片法，建议用STEMCELL公司专门的培养基，小鼠的MSC形态就是不像人的那么好，我把我自己整理的实验方法发给你，希望能给你参考。" q' P2 Z/ c. [+ R5 j2 ^2 f/ f
原代MSC培养
. A" x9 u6 M3 D3 m: U1.        断髓法安乐死处死老鼠（4-5周龄，雄性BALB/c鼠），在酒精中消毒5分钟，无菌取出后腿，去除韧带和多余的组织，从踝关节和髋关节处分离出股骨和胫骨，置于加双抗的D-hanks液中。
  Z7 c) |7 ^# D: S) h3 L2.        用剪刀和镊子彻底地去除肌肉，切除骺端。确保骨头上无附着肌肉。
: s* |+ j3 `5 p. D+ _. t3.        将骨头放置在10ml缓冲液中，Buffer: PBS+2%FBS+1mM EDTA。
/ Z  z) z3 k% }4.        用注射器尾部圆饼摁压骨头，力度要轻，使骨头裂开即可，轻微搅拌使骨髓从骨片中释出，用移液管吸出缓冲液。0 Q5 _, u) s5 `  H
5.        加10ml新鲜缓冲液重新搅拌洗涤，去除骨髓，重复5次，直至骨头洗白，大部分骨髓被除去。
# ?# Z' Z4 h1 O, f. h# r: Q6.        去除缓冲液，加入2ml 胶原酶I溶液（0.25% 胶原酶I + 20% FBS + PBS），预消化3-5分钟，使骨髓软化，容易切碎。
& r; b4 x/ B( B3 j) B  A. p  O7.        用剪刀剪碎至1-2mm，以保证释放足够细胞量。
8 `2 w7 `' @# D% X2 m) F4 P* g% a- {8.        将碎屑放入50ml离心管中，加入胶原酶I溶液至总体积10ml, 或者2ml/鼠，加封口膜，将离心管放置在37℃摇床恒温槽中最大速度消化45分钟。摇床的速度设置为200rpm。- L2 y; f8 l) b9 z8 p+ t0 r4 G; X: {
9.        加入缓冲液到总体积30ml，1200rpm，室温离心10分钟，制动打开。用MSC培养基将细胞重悬浮，接种于T75，骨片也一同接种于培养瓶中，让其均匀铺开。置于孵箱孵育。
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clairezy1983

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0 R$ u7 `6 J# A# U% K
' n  Z/ C! y; f% c# R" Z小鼠的MSC形态跟人的没法比，人的MSC形态比较规则，看起来挺整齐，小鼠的MSC样子挺丑的。我已经很长时间不养小鼠的MSC了，现在主要做人的。
7 k$ t. @! T! A# k" m# R5 B6 @4 o+ g( t6 @你用骨片法的时候要把骨片一起种到培养瓶里，放入孵箱之前，摇晃均匀，最好三天都不要动它，可能要更长时间细胞才能长满，然后你会发现从骨片周围爬出很多比较整齐的MSC，有的时候呈放射状。你要是总是不同的观察，骨片就飘走了，不利于细胞的爬出。
+ j5 _! g% M4 J% n/ c' Y他们公司的protocal里面说的还要过滤，这一步也是省略的，因为要直接把骨片弄进去的嘛。
5 U. \4 K2 o/ ~% i8 |还有碾磨的时候一定要动作轻柔，垂直用力，而且要轻，只要把骨腔打开，让血液出来就好，千万不能左右摩擦。
$ o: ?; o% y3 }' R& A  u/ M7 z碾磨之后冲洗的时候也得温柔点，我有一次就是冲洗过度，洗得很白净，但是干细胞也没有，那些红红的血水去掉就好了哈。
5 m0 [/ }: R0 l  ]传代培养的时候密度最好大一点，还有不能消化过度，很多消化不下来的细胞根本就不是MSC哈。据我的经验，MSC很好消化。
! Z9 o6 ]7 L& |* x暂时就想到了这么些，希望对你有所帮助。

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子/ u6 ~3 o9 |. s. Z" q# p2 N- f5 x
3 b6 z" R$ M' r
恩，你试着降低胰酶浓度，和消化时间，不要期望把所有细胞都吹下来，很多细胞消化不下来的都不是MSC哦。

clairezy1983

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$ S# c% K! Q5 m) L+ p7 ]/ f' g. q/ O0 b) _) P2 h! C
浓度有点大，降，大胆的降哈

clairezy1983

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) @. o( t2 w4 z  }$ D% f我现在都是做人的脂肪来源的MSC，没有做鼠的呢。我是做成脂成骨诱导。

clairezy1983

回复 asejon 的帖子) ?2 A8 j2 K/ l* [
2 m1 K% u2 {/ S) r
不会，培养基没有适合成骨分化的条件啊，骨细胞更不会吧，我觉得那些干细胞应该是从骨膜上爬出来的