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3 f( @" H$ B5 Z% N' e% b
荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交
% |. |: T8 r, A6 |0 ?! B+ F& s# s; J: A5 |: J
实验流程
% x, o% X6 w K( s( M4 L
- O q: W+ n2 R9 r第一天
1 r" }8 m- U6 F4 S1 q8 c9 T, d8 ^) k缺口平移标记探针( E9 x- l/ e: N. B. y5 c6 ^& V
1.1 试剂准备
- @ V$ b6 p0 m. I( ]5 s$ K(1) 0.1mmol/L dNTP5 H; J4 \' c8 H P3 W7 C
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。4 Y$ [. Q- k d1 E6 D5 N
(2) 0.1mmol/L dTTP/ U7 Z7 h% `& Q; j
1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。
, M: ]! t) l: R7 w$ S1 H! q1 o1.2 缺口平移体系和反应条件3 b$ j3 u: c M2 i
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
2 w8 e2 _ [1 l6 u0.1mmol/L dNTP 10μl
. M& {4 ]6 d! u7 U5 B* y10× Nick Translation buffer 5μl6 K5 h& n# F) H& E# f
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl( g/ d L& W% U8 ?
Nick Translation Enzyme 10μl
) N9 @2 U/ m& u% YDNA (1μg) X μl
5 @" V' `" \0 X4 N# zH2O 18-X μl$ H5 [+ ]3 z5 N' a8 Z: K" F9 S$ a) _
in total 50μl
, R5 l, I+ w: i0 b4 e以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。8 _2 P) l, ?0 ]" }
1.3 凝胶电泳判断探针大小4 @& J% |! v g0 X, P3 J1 {
将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。
9 m5 J+ V/ R: c% i P8 T1.4 终止反应
^# `/ k! l4 H2 p向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。1 X, l7 q1 ?* c* w. A
* P9 t6 f& \) n2 R) O3 b
第二天
" |7 F9 x L$ @0 z. W1. 探针的沉淀和变性
4 \4 h# V# R+ T' `1.1 探针混合物的组成5 F$ Z- s. ~* Y1 C5 u; V
(1) 对BAC/PAC探针# N; Q6 j& n8 \" c' i- j6 E O+ T
DNA探针 5ul
! g7 ~- `/ q' p: QHuman Cot-1 DNA 3ul
+ }( t% c0 n( E+ a" X( sSalmon Sperm DNA 0.5ul+ p9 @. n# P- I9 v
H2O 1.5ul4 [. x7 A" z4 |# W& d
in total 10ul% a) n1 q: w" {' _5 ~
(2) 对着丝粒探针:7 |7 m% k# X2 H3 X2 @" }0 M
DNA探针 5ul5 T6 g' {6 x0 i5 H- c
Salmon Sperm DNA 0.5ul$ z6 y4 w& Z8 [3 q( k7 R, L7 v& m
H2O 4.5ul; @% j( P1 x$ O) I/ x; _
in total 10ul. o. F2 h1 U6 S: r: _
1.2 DNA的沉淀
* {1 B( s: N2 g- _& F将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。
$ r$ O- D% o1 N- N1.3 清洗沉淀$ O% F- Q* k5 N3 x7 F0 E+ u( f
小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。* y! z4 q! S) n- Q/ z; O5 [% o
注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。; c' [7 M1 ]$ d# d4 L+ v/ c0 x. Q
1.4 溶解探针6 f$ M5 \6 O( q2 l
加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。
. o5 ?& _, U- d& p0 ~- ~7 J1 j+ \4 _注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。6 o4 B4 `' X- m+ n' a6 J! X( ~$ i
1.5 探针的变性和预杂交
- l# f' R; J: M5 B短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。8 z* o O/ A1 ~
2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性
0 W1 T/ r, Y) P; F" n2.1 滴片和老化! p: S0 z. c! U$ @, G
取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。
2 P/ l/ V( p# X K2.2 RNase A消化
- `# p0 K5 q3 S5 q! q每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。& X7 P* J% [+ U/ Z
2.3 靶DNA的变性. r4 ?5 V, u2 i7 P# _$ c
将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。
' p. d d U0 B# u2.4 蛋白酶消化6 F5 o1 Q* G y4 U! e3 _' m p( F
将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。4 h! \* z9 }6 L& n# x$ x3 b: v. ^0 L
注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。9 I' |# F5 W- k0 D) ?' P' L- z
3. 杂交
4 ~+ h9 G5 J* Q7 W i将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。* l( J0 y; z6 r/ W# S6 f6 _* v
, ~ e# H6 Q6 v: N% D3 a' ?第三天
! h! S0 y- v: ?9 X+ W3 [! K1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大
% t4 M5 p9 e' U3 }7 N1.1 杂交后洗片
) |4 e+ l6 f) |0 w* @) ~% O小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。/ ]5 i' W5 i- g' _6 F
注:此后步骤应注意避光操作。
9 A$ x2 d& R) C* ~# F& a) x7 w1.2 滴加一抗6 Y$ i/ p% z& y
将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
: M0 n: K; R0 t7 T/ ?. w& f0 N) Q1.3 滴加二抗* F" P; b$ W+ O1 W& |
将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
! |0 t, f! U8 j" r# U1.4 滴加三抗
3 W3 ~* \, X7 K& w f. q& d将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
' x4 p" C) z$ ?8 S, T注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。6 `* x& g+ d/ B5 r- r- R% a
2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片/ m+ e0 w9 g6 C, [0 h
将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。
3 x% S) q6 `" T! O4 v4 g3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号
, A9 X0 ?8 u) `% z- c' U+ N# J以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。- c, g& G- T v- i: @+ y" o5 j
4. 储存数据 f* t- x4 U$ v' O" I* \
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