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/ F+ q5 O L Z. V. W2 j% y
荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交
, o3 S2 J/ T& B, E7 C# @ T/ h; ^* \& d1 L& s$ k
实验流程 - W& g4 p' g( L& d( T- F( a+ m) q e
( |. d: l& U- V. D5 j2 d
第一天
; v, u+ [* \; C9 M缺口平移标记探针7 ~- ~8 W$ m; c7 O
1.1 试剂准备& r* c* y0 x5 U, Q; F% O0 p: r
(1) 0.1mmol/L dNTP% b. G1 H5 {" N, v! H% M
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。: b5 K& I+ j. c; ?1 q' e
(2) 0.1mmol/L dTTP: v) B- i$ o# d! X4 ?7 L
1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。, M+ r% }+ G( T/ e) ^1 ]7 r }' l
1.2 缺口平移体系和反应条件5 {/ a' g) _& T- R" ^' w( W! ]2 P
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
5 I2 Y3 Z3 c2 r4 b( N% N0.1mmol/L dNTP 10μl
# u) ? K6 D/ r0 k! v: g; i: p' c10× Nick Translation buffer 5μl7 R9 D4 D: K- v, n
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl; b2 ^! t! d: N2 a: s) u' M* @; I
Nick Translation Enzyme 10μl
: j% `/ m3 v* s7 n" p: KDNA (1μg) X μl, ]- K' Y3 |0 M$ D- y8 A
H2O 18-X μl0 [: |3 v* [) l7 ]$ `; s3 A$ _
in total 50μl+ z c/ O0 ]2 v5 L3 m# T
以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。7 n9 V7 I7 f. B/ L- ^6 _$ g
1.3 凝胶电泳判断探针大小3 C) X$ r2 o2 ?0 l
将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。
5 p# F! b# |& X6 I J0 S$ g1.4 终止反应9 p) }+ R' w+ X
向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。4 O$ d& [- K9 w# _, |8 L; f
3 \( O3 r* f. Y" M# c/ I+ d3 j第二天( L* t- r1 i8 c- }1 T' O
1. 探针的沉淀和变性
; |6 C7 F- p) W; b1.1 探针混合物的组成- s, j( H# B1 q: n/ F% Z
(1) 对BAC/PAC探针
- z2 G4 x a* e MDNA探针 5ul
" D7 j8 f1 l( QHuman Cot-1 DNA 3ul
' w4 U r9 E: _8 m% g* u& hSalmon Sperm DNA 0.5ul7 Y) Z- p4 Z i/ o
H2O 1.5ul
* o0 h/ T; I* M. D: @ n$ \6 c, Sin total 10ul
8 K! G: D' l; \8 @- P(2) 对着丝粒探针:
" K) L+ O) P$ d `7 D0 b! EDNA探针 5ul
' _! y6 `7 @' ?1 F, n$ N0 V' ZSalmon Sperm DNA 0.5ul) N; G/ Y) W3 v4 r
H2O 4.5ul
! r7 \, h$ U+ _in total 10ul
. p4 l* b. q7 S& ]+ e1.2 DNA的沉淀9 z9 Z. j! e8 M& T4 q
将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。
' a( d8 {) a+ c1.3 清洗沉淀5 B q, G6 s8 F+ I2 m6 p( Q9 j; @$ C' F
小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。1 ?% Z: W$ O) T& ]) s
注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。
3 `. P7 ]. j7 N7 ~2 V2 o1.4 溶解探针( [5 `& g" B. a$ I, X' l! q& p+ l
加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。
4 r9 U7 ? @. o, V- s$ d/ c注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。( a/ a" r8 d5 |: q+ u5 U
1.5 探针的变性和预杂交
( o, n" P, N: b# J6 M: N$ u9 Q& `短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。8 `! {* M {: k+ c; i: |5 y
2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性% I- Q+ h; D3 S
2.1 滴片和老化# D! t/ E$ I9 ~8 @6 q3 \( ~
取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。( h8 G+ [& ]7 R: d2 R' c5 ]
2.2 RNase A消化
0 O# t" v7 F. m& U, ]& n每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。8 ], _- r- T" ?+ @
2.3 靶DNA的变性
4 ^6 s' S- N, k+ x4 b! m. T! U8 Y6 R将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。
1 `& ?, [: N, i w8 `. W9 c) u2.4 蛋白酶消化
+ M* ^ W. A# M将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。
. Z7 a( k. c" _7 i9 T注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。
% x" M, H* `9 B5 H; F9 u3. 杂交
. A, b9 f' L. A5 p6 D A# h9 j9 I: e1 U5 |将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。1 h: E5 e$ P+ |' {
6 u! k* s! S! T, r第三天
% r) s' ?" S( W F' j; D6 V1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大- ?# m* g7 j& l5 q: c3 ?8 T* ?
1.1 杂交后洗片 g5 u. _$ |: J4 |9 Y7 H
小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。) i& W% H, j K. b3 W
注:此后步骤应注意避光操作。3 ^5 g. {) C4 x0 o4 E: Y
1.2 滴加一抗# f9 d, P! X& Y4 |% J. I( E$ K
将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。1 K$ ?! E( l4 `5 T; J6 c/ v
1.3 滴加二抗* F6 ]9 l7 L2 S: r3 Y
将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。& @/ Z: m1 _8 Z6 a; J# z
1.4 滴加三抗6 W" a1 L k* f' l) ]! t) p" x" O
将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。. z# u. ?- `! r. {/ J9 j
注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。: L$ R+ P2 o, b; b
2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片5 a# g3 @( ^8 }* V Z
将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。
5 w3 x! }/ C: _/ h2 L3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号4 ?( K( s9 f9 r% t2 o) w
以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。
) n! W( s3 a0 o: c5 J4. 储存数据
) g# [$ G' Q7 d& N, P |
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