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6 `4 b7 \: \* f, U" x" _
6 r0 j- l$ g6 k& C; A荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交
. R# l" j: z9 Q, |% f" l1 Q( V# t' T/ ~1 C
实验流程 0 i7 U* e5 q" a2 `' b1 e+ C
/ I% ?9 ~! m- I5 m1 _: O第一天
0 j% g* t% V/ b, E/ V* T& K缺口平移标记探针- C- f+ u" f8 U$ _ V% t5 \
1.1 试剂准备
6 K. d2 @/ b% k% g: k(1) 0.1mmol/L dNTP U+ r! S$ U$ I
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。& X$ U4 _7 W7 t& _; f
(2) 0.1mmol/L dTTP
5 e/ J t7 `2 T3 g1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。
) S3 f! |/ x5 |% x8 n1.2 缺口平移体系和反应条件- A3 O4 W% e% |: [
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
( Z, Y V) Y T! e0.1mmol/L dNTP 10μl; k% u' n* `8 s- X) a* _2 |" a
10× Nick Translation buffer 5μl8 p8 l. d/ b7 r; n3 Y8 F* d; k
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl
" e2 V Q' @* gNick Translation Enzyme 10μl4 Q" x/ j7 o+ u) _3 T. R' m
DNA (1μg) X μl
5 e& \" H7 k* q7 E* f+ |H2O 18-X μl7 N' m3 x7 c0 z4 e6 r
in total 50μl
4 [; [9 P8 O. \5 W, x# D以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。
0 l: M! f# F& _5 L' D, D" E1.3 凝胶电泳判断探针大小* y: m6 U! z5 Y9 {; j: o6 c9 i
将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。
5 m2 j% @# `/ j7 j& I: |% [/ i* j% W1.4 终止反应" L3 s& j; o1 H* c
向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。1 T W- r4 L) g2 w# z$ r& n
3 D, l/ R+ e! w7 [# A+ W第二天9 N& H9 f* f" ~# W! p$ g9 D6 _9 P+ D
1. 探针的沉淀和变性
6 |" e$ g' o! C: E0 u1.1 探针混合物的组成# b6 B* F* v( ?
(1) 对BAC/PAC探针
- G+ N7 |% f$ e- `0 [DNA探针 5ul
( o; e) o2 j H. t' U6 G7 vHuman Cot-1 DNA 3ul
/ `6 @& W7 O8 m, gSalmon Sperm DNA 0.5ul u' a) Y; M* I. g$ |7 i$ }( N
H2O 1.5ul; a( H* Y4 r4 z8 a; G: G' @
in total 10ul
! V: Z# a& W; P" w(2) 对着丝粒探针:
: i- N# k" H4 v1 wDNA探针 5ul9 B; m6 ^0 u! r, E
Salmon Sperm DNA 0.5ul
- \/ B8 P% Q4 Z6 w2 \) cH2O 4.5ul
9 N/ e" ~% z2 h8 ^# nin total 10ul
3 X# x5 S, }, z8 l- X; ^1.2 DNA的沉淀/ w' T" c7 \, I5 c
将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。
_6 t$ a$ B- J7 n& F1.3 清洗沉淀
5 k: G, G) w J, J" A" \) @小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。# D: ^$ }5 p! Q6 G
注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。8 y! G+ l( X2 @+ E6 X' f
1.4 溶解探针2 e2 a4 L; t+ Y2 N B; D, w/ z
加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。# O# x/ ]$ l7 v5 C) M
注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。$ x; [) s: R8 R8 i- x' Y/ w( k
1.5 探针的变性和预杂交
$ v5 n/ F1 U' u- `短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。
& r& _. p9 \6 B1 R) U. b2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性
) C: f4 F8 X7 q8 U/ ?2.1 滴片和老化
) A, x6 K3 ~+ b, Z取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。
5 C3 c# A% P- H$ \, t: @! L2.2 RNase A消化
: a' ^& Q; O5 f* r& m- s/ Z每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。
. c/ i8 [; m7 e4 ^: y/ s$ f2.3 靶DNA的变性
8 I, E7 `8 z% j) g9 o8 q: k( }将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。* [: K$ u6 I$ J7 K6 A! q1 e% X
2.4 蛋白酶消化
, [6 r# K% @: t9 O2 d2 |将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。
" J3 c" k# E( z0 a% V' p注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。4 @1 r7 o; _! E5 q
3. 杂交
$ p2 ?; {, L! v8 d( i" p6 a将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。
4 p2 q, p$ x: T* d; X1 A6 W* {
第三天
+ B8 v- N& _, m f9 g6 Y/ V1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大3 u7 G0 c ~4 g# p( U \- u: M+ v
1.1 杂交后洗片" w$ x! h- F9 g3 ]+ `% ?/ f5 e; `: }
小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
$ p) T+ b* v6 p& E$ m; F% j* Q$ |注:此后步骤应注意避光操作。
- U% [8 F: L! G+ @+ O1.2 滴加一抗
0 u- }" E8 U7 }将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。/ a+ {0 ?- u; f- B# d2 Y/ O
1.3 滴加二抗
7 F# k& {2 K8 Y! e& o0 k* N将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
# _" M3 W3 G. G0 G" i& F4 h1.4 滴加三抗
5 D0 s3 Z$ h, A! ~0 R+ k7 n将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。4 T+ |4 s# L% A8 x) Q/ ]
注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。0 r+ ]6 W# j. A) n- h" i, @
2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片
% g" u( l$ s3 p" Z D- a/ _+ C将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。
% h5 `& q" S% H4 ?% g& w, v3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号
& `* m l" W& a' o以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。! u# z4 N9 R. M6 v
4. 储存数据$ H8 d" o2 l" f! x# ?6 V5 |
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