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) {. y5 }$ P9 s! u, r9 }4 ~5 F& u9 k# S8 A* U( M8 p
荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交
: |( ^5 W/ F- S7 W+ g* N! d7 l
G K" S7 ^7 I" ~0 } ]$ |3 x实验流程
' q6 J0 i5 m& v& ?1 Y0 r: [8 U7 H v& [/ {
第一天
! L$ q8 ?- q* v! Q( Y缺口平移标记探针
4 e% W4 P+ x" |3 x4 {% I1.1 试剂准备
4 h* ]9 A& m. B4 h(1) 0.1mmol/L dNTP1 _- w2 J& O# J( N: h8 R+ Z3 l
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。
- H) U) \) p0 v4 x2 P- \(2) 0.1mmol/L dTTP3 y- d9 m. [1 D) D3 c% x. G" O
1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。/ S1 H# k$ z; [. K$ {
1.2 缺口平移体系和反应条件1 l3 X1 o( [! B/ |$ g# K/ s
0.1mmol/L dTTP 6.5μl* P& b& x' Z/ O- c" P. H
0.1mmol/L dNTP 10μl! V/ H1 c; V! D3 X% R5 P( y( c
10× Nick Translation buffer 5μl
+ F* X3 e. S3 {3 s+ A$ `1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl1 r3 a8 x- P$ p! l5 L* o
Nick Translation Enzyme 10μl& {/ l- Y4 U1 X; I6 u
DNA (1μg) X μl/ e/ [. A6 f+ b! z, Y# n
H2O 18-X μl
$ J5 Y; B1 |' l$ {3 o W5 t1 q0 y6 |in total 50μl
2 O4 t5 q2 E" A! c; ` k5 Z以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。
1 X X1 V/ o; @0 P i) P1.3 凝胶电泳判断探针大小% P' d+ S5 `4 C
将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。, c4 ]; Y9 z% c6 i6 s
1.4 终止反应
! [& ]$ d) x( Q3 @! j, ]向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。- X- z7 X% c2 }. d& `
/ b/ j M1 d# K! c! i' f第二天
; S7 {5 j0 J- j: Y3 t" v* x1. 探针的沉淀和变性
. H, r, k+ L+ k% ]4 A3 v1.1 探针混合物的组成; q; L& i/ n: u
(1) 对BAC/PAC探针* I, ?! g! i# P' `' m
DNA探针 5ul/ Q; w+ ]- `0 O$ T) w0 h1 K& S
Human Cot-1 DNA 3ul
9 u5 W6 a$ n9 i, S8 \' ~Salmon Sperm DNA 0.5ul" M1 w8 l' V& ]" L7 A
H2O 1.5ul
1 m- n* J1 H! W2 [1 |in total 10ul2 ?9 q$ ^6 s- I% B: R6 N1 o+ m
(2) 对着丝粒探针:
2 [. d8 X+ z$ tDNA探针 5ul
( |+ X4 t% [( d2 }' R, YSalmon Sperm DNA 0.5ul0 m5 F- Q U. v) y3 b: X) A
H2O 4.5ul, H$ _. m& C% S6 J" d
in total 10ul
$ ~( l. C, \: T U1 g1.2 DNA的沉淀
8 z9 r8 B/ E/ |; u( h; s" {将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。
I9 E0 M1 }3 k/ E8 {1.3 清洗沉淀
6 T" I) F; m9 s7 S. b& W* n9 d小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。
4 P3 w' \* U9 |. V. t& A注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。# I& Z& l% y7 I8 {3 n) J
1.4 溶解探针; g( ]. m. }% Y
加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。
4 {6 m* H7 J* r4 I+ K注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。
: I& Q8 t2 L5 y0 L1 L! {1.5 探针的变性和预杂交( g- P* u! ?* A- T
短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。) \- n3 u0 A0 \) I6 W: Q
2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性
% g/ `% m& }# G$ b6 `& U3 n2.1 滴片和老化
y$ P+ c1 c H取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。
1 K8 L/ O2 u7 N" I9 q- K1 p2.2 RNase A消化! T: [8 X2 {; Q- q! E" e3 c
每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。
+ | R+ o4 ^) D$ I2.3 靶DNA的变性
. k, [3 s9 s- z9 U! |% R将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。
4 }+ A$ @* Y& X1 ] I: v7 T- w2.4 蛋白酶消化
9 [/ Q9 {) N: l/ E将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。; {# |4 t4 b d; I
注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。
5 |" Q. b' I7 f' a, |3. 杂交
* K. ^+ D. _+ h) q8 `# [' [; G将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。1 P+ ]2 E) W8 \; r0 R; c
. e4 C/ C! d# |( p2 r' V/ W
第三天
/ ?* a& T7 J) G1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大% ]+ p) Q1 ]$ d/ t
1.1 杂交后洗片1 F* x- r! j M3 d, q
小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
, ?& y6 i8 v5 J f+ _注:此后步骤应注意避光操作。
5 \ a( q( C7 `( Y1.2 滴加一抗
# }, E- }# j. c将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。5 N, U' C( B0 r3 x* j1 h
1.3 滴加二抗
; |& a, y3 u# ]7 m( @4 Y1 _将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。2 k. N8 Q# z5 d7 ]
1.4 滴加三抗( J' i; O9 u* r9 K
将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
. D. j+ a3 U1 s+ ? a/ Z5 i注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。
~9 j' A5 F0 ?* m6 T9 f2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片" O3 C7 Z( g+ J( ]; T
将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。
& D' O. o. ]0 c+ p# M- f7 G3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号# y4 E( O1 L- d9 v: |
以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。- A. ~% z5 X( V
4. 储存数据
- R, e1 V3 |. t- z |
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