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回复 hualin840518 的帖子5 }5 v. `+ O. a( h3 X& c% I
0 r) ~3 z/ H0 |; P* O' i荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交$ L" V" Q3 F, W: _
& [0 A% K- U: p4 }
实验流程
4 ]+ _ s& _' Z6 X- n, ?+ k
& Z4 k5 t: s+ {' k" U+ t第一天
. m5 y& K! ?, i% X$ n+ `缺口平移标记探针6 f1 ^# S$ B' d; ^
1.1 试剂准备& y1 r" c) g* `. ?/ {
(1) 0.1mmol/L dNTP
E. x" ?. C0 ~9 r0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。
/ l5 Q% G% Z" D6 ~(2) 0.1mmol/L dTTP- K" S b5 B3 v- I: X
1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。: f# C7 M& m7 X. g- u! A7 ^3 V
1.2 缺口平移体系和反应条件
4 F4 Y2 A1 X R0 V N: q2 P0.1mmol/L dTTP 6.5μl
# Y/ d$ X a- ?" ~7 w5 f# m4 `0.1mmol/L dNTP 10μl2 k2 u- d- B3 w) H5 v9 [
10× Nick Translation buffer 5μl1 v y0 `# [4 h
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl |/ H. |+ w7 A) I$ e, J5 f9 g0 S
Nick Translation Enzyme 10μl
1 Q4 V) Q; Q" j0 N- g' w: BDNA (1μg) X μl/ C3 X) z- W8 q2 {" w6 J, y
H2O 18-X μl
( b' R: z$ j# C4 H- E: {. s: Uin total 50μl# [0 k6 B4 M0 Z" Y. j4 J- l# \% [
以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。
0 G7 a( R9 x% ~' @- c' U: g1.3 凝胶电泳判断探针大小7 H$ G, T2 L. E3 g s9 F3 }
将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。. s; Y. J7 \( A$ b8 K/ L
1.4 终止反应
) s$ E1 U% {4 a6 K! X$ u向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。
5 L# S/ e/ k: J9 T- E; K: J
+ H- z; b$ P/ o d+ }, F) }第二天
7 {% h2 C7 p& q# P, ]% Y7 B+ u2 J& Z1. 探针的沉淀和变性2 x: e c- {" M' g- f" `/ f3 [
1.1 探针混合物的组成
/ }) x/ M0 q: W7 C1 J; f(1) 对BAC/PAC探针
; `7 e* {* ?' xDNA探针 5ul4 p& j9 \& u0 i
Human Cot-1 DNA 3ul
, W- W+ i y/ ?3 n# rSalmon Sperm DNA 0.5ul" v- r; T& e( u. T1 J
H2O 1.5ul
7 m- @7 s! S) L' B( E. Zin total 10ul$ K: M* X9 |) U" _% i5 e
(2) 对着丝粒探针:8 Y- b* |+ l+ r# x
DNA探针 5ul
8 Y/ P Z( o4 `, S- h* MSalmon Sperm DNA 0.5ul; y& q5 |1 v5 ^
H2O 4.5ul
) H1 U: y% E/ Z! [4 n' Win total 10ul
( B1 k j Z7 T" O1.2 DNA的沉淀+ i* @8 w2 \, }7 C$ l
将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。
6 l* }0 z# w" @; _1.3 清洗沉淀
`; t1 Y6 V2 H" h小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。
; _0 Y6 F, i3 z1 t3 Z4 }% x注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。
2 ~* b- L$ ~$ l" y1.4 溶解探针0 W/ l8 y4 S7 C1 j4 d2 @( y! |
加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。- _, R# _+ V0 p! J
注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。# Y4 h8 X1 S2 {. _3 C9 x1 W* k
1.5 探针的变性和预杂交
# r. Y+ g& ~; I: K短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。3 R3 t4 d6 d/ x; P7 G
2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性
& s: Y$ S# s9 W6 E W4 k9 m5 s2.1 滴片和老化
* Z5 S s# I% @5 l取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。( l9 r! R2 U" p! W" j( A
2.2 RNase A消化; L) u$ U. z2 D& e+ c5 F' ?
每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。
3 l( K! o6 z4 O5 k3 d0 F2.3 靶DNA的变性
* V2 D! z* w: w将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。
5 C" h' H4 j' V- `6 B/ F1 f2.4 蛋白酶消化5 h! o" h' Y/ p! `9 X3 J5 E1 T
将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。$ M' s$ @2 t6 m1 _7 y1 j2 h4 z& E
注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。9 {' B$ y" b6 y5 z+ m
3. 杂交$ K. F' ~+ R; L* F9 J. J! h* n1 S! U
将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。, A/ u# q+ R5 M% V [- H
, }/ t; R" T7 o9 G/ @
第三天3 e4 T3 W/ l$ u% _
1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大" Y1 Z7 R1 a/ ~3 p" i, x
1.1 杂交后洗片
$ Y9 Z2 }% t' n$ n3 H; S& e z小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
9 T" v8 W. c& ^注:此后步骤应注意避光操作。
. \; z7 ?- v3 ~9 E, I6 c2 z) h3 D1.2 滴加一抗+ V% a7 c7 h/ V) o5 e! T, X- C9 c$ g* L2 z6 R
将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。5 `7 [' Z$ F; O0 \1 ]; n+ _9 ?
1.3 滴加二抗/ q! B0 ^5 t" U
将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。" _: t' W' e8 q
1.4 滴加三抗3 C& }* O* A5 F
将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。$ z: W' O5 y z
注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。 T, A6 y5 v8 ^3 R# p* J
2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片9 ` c( X0 d: s+ u
将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。
$ k# s+ x+ R- V4 Q, [$ s6 ]3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号
/ \" [0 Q: e- t m. q以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。8 r1 f6 K8 ]( L, k1 a5 F G E) d
4. 储存数据9 }) e- R& x% `
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