MSC成脂肪分化培养基配制、诱导方法和染色方法

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7 J# ^( O" M! U- ]8 r0 p! M/ k7 y+ ta)成脂分化诱导培养基的配制) c3 P/ v; r& n4 V2 \
将胎牛血清及添加物加入基础培养基配制成脂分化诱导培养基A和B，将配好的分化完全培养基过滤除菌，储存在4℃。 $ q' E# s# b8 e' N$ G  L5 O5 z
成脂分化诱导完全培养基A：
& h8 ]+ S& R4 @7 _' a( r& L成脂分化诱导基础培养基A                            175 mL 2 u$ u9 ^5 m1 ~9 U( I
Fetal Bovine Serum（胎牛血清）            20 mL 6 H) ]: b5 _+ p9 u: j) M# t/ C. A" X# {
Penicillin-Streptomycin（青链霉素）        2 mL ) e" \) n. ~# t* W& A- C# U
Glutamine（谷氨酰胺）                    2 mL ( x0 }( C8 }# L# A/ R
Insulin（胰岛素）                         200μL 7 v3 m% C1 P, y9 s3 r7 q$ v
IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）            200μL
/ E6 X, p  V+ s4 }0 ~4 AIndomethacin（吲哚镁锌）                 200μL
( a3 {+ \$ L7 m1 r4 R1 O) ?Dexamethasone（地塞米松）              200μL
7 W& ]' O9 F& h+ n: o0 C0 ^1 `$ o成脂分化诱导完全培养基B： . m8 m5 i2 o$ R5 J; ]8 t
成脂分化诱导基础培养基B                             175 mL
$ B* a2 r, C7 ?Fetal Bovine Serum（胎牛血清）                          20 mL
; U1 y8 w. d3 v) `9 @) oPenicillin-Streptomycin（青链霉素）                        2 mL 3 L" X* K0 G) G, {9 G& ?- ?" u
Glutamine（谷氨酰胺）                                   2 mL
' I7 ]& W$ A* U3 w' SInsulin（胰岛素）                                       200μL# Y: O0 Q+ f0 S, T9 }  R5 q1 W' N; P# X

3 C2 Z* |4 E% u/ \: R/ vb)诱导分化：
7 n+ b* E* k* V8 m$ B/ C$ U1)取P3代细胞，2×105/孔的密度接种到六孔板。& K4 C+ z* X1 `" f
2)37℃，5%CO2培养。 * y( Z2 T$ d1 A# v5 |! o" ]: f7 `5 {
3)每隔 3 d换新鲜生长培养基至细胞完全汇合。
( T) H  b0 x, j# ]/ h4)吸去上清培养液，每孔加入 2ml 的成脂分化诱导完全培养基A。
# l4 r- Y/ e2 X$ t, D: H5)三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基 B。 8 G$ n8 n* \/ `! x7 A2 }
6)24 h后，再换回成脂分化诱导完全培养基 A 进行诱导。 & c' c. i" V/ e- w, X# N
7)循环 3～5 次后，用培养基 B维持 7 d，每三天进行换液。
; S4 e1 |2 f- R8)分化诱导3 周后，固定细胞并用油红O进行染色。1 Y" W, ~7 w' m) J" [

2 m7 X/ t$ u; ]2 u; _" r0 k9 qc)油红O染色
& }  n- q  u, U# [' _& Y1)去除诱导培养基，PBS 洗两次。4%中性甲醛固定 30 min。
* v/ Q3 z/ K0 G& E2)吸去固定液，PBS 洗两次。每孔加入 1ml 的油红O染色 30 min。 . |1 L+ c( D3 ^) M8 W9 ~7 i9 K
3)去除染色液，并用PBS 洗两次。拍照。" S/ o2 o- z9 y3 ?" d