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3 g" l2 r" r3 S- i
a)成脂分化诱导培养基的配制0 | O5 @6 y/ E) U
将胎牛血清及添加物加入基础培养基配制成脂分化诱导培养基A和B，将配好的分化完全培养基过滤除菌，储存在4℃。 ) N7 {2 Q3 l8 h) X
成脂分化诱导完全培养基A：
- s$ ^, `( y, c成脂分化诱导基础培养基A 175 mL * Y2 ^7 u: ^0 i) w
Fetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL + v9 J! W+ q1 W- ^8 V" G
Penicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL
|5 x2 e: K0 y, P1 O; QGlutamine（谷氨酰胺） 2 mL 5 B/ |1 }2 b1 c+ ~; g9 y5 g4 M
Insulin（胰岛素） 200μL 8 w3 R0 L/ O# \" e
IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） 200μL
: M4 n! l& ]( [ G6 y, W' P+ ?Indomethacin（吲哚镁锌） 200μL + @, {2 T1 J: w' O. t' `4 x
Dexamethasone（地塞米松） 200μL
% b/ d/ I' t' ]& y成脂分化诱导完全培养基B： & Z! `! r1 f/ E' b
成脂分化诱导基础培养基B 175 mL
" C+ G3 S& p( W; }5 rFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL
; y* r5 m3 J2 d! rPenicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL
" N1 l8 p6 M# a. \( zGlutamine（谷氨酰胺） 2 mL , ?/ ^; {; ^7 i" Y$ c
Insulin（胰岛素） 200μL& I! M# H- L, F" K& F: ?
3 R Y# K" k( q/ Z
b)诱导分化： . c% }- g. S: E3 h* S& ~# L+ I! l+ s
1)取P3代细胞，2×105/孔的密度接种到六孔板。3 \" I( \$ ?' Y! G4 y6 B
2)37℃，5%CO2培养。
5 P% ]; u! Q! A: U3)每隔 3 d换新鲜生长培养基至细胞完全汇合。 / B2 G1 x# z( H! }
4)吸去上清培养液，每孔加入 2ml 的成脂分化诱导完全培养基A。
6 k1 K5 w; T# Z3 g) j7 V* f5)三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基 B。
6 I( u: [' o2 Y6)24 h后，再换回成脂分化诱导完全培养基 A 进行诱导。
9 [3 W& r6 s; H, [, i3 l7)循环 3～5 次后，用培养基 B维持 7 d，每三天进行换液。 1 t3 N0 s" N( a/ t+ z+ K4 _7 v
8)分化诱导3 周后，固定细胞并用油红O进行染色。1 P$ D8 m0 H b0 \1 h- ?. U
/ `) h. O; U% O7 g8 yc)油红O染色
9 l: q# M; s1 ~5 ^- o2 p1)去除诱导培养基，PBS 洗两次。4%中性甲醛固定 30 min。 " b+ ?6 e9 O& N$ j
2)吸去固定液，PBS 洗两次。每孔加入 1ml 的油红O染色 30 min。 * I4 x5 c! Z3 K; G, g0 W
3)去除染色液，并用PBS 洗两次。拍照。
8 ~9 m% Y& J9 S |
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发表于 2011-5-3 14:26
发表于 2011-5-3 14:51
