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( y) G; P, V* ?5 ]& ~
a)成脂分化诱导培养基的配制
9 |/ }$ l8 ^, T将胎牛血清及添加物加入基础培养基配制成脂分化诱导培养基A和B，将配好的分化完全培养基过滤除菌，储存在4℃。 4 p/ B2 n9 r, C3 H) R) E: X$ K6 T
成脂分化诱导完全培养基A： 1 Y# w2 w- y& Y5 j4 T% S
成脂分化诱导基础培养基A 175 mL
5 p/ X3 T1 Q: ^9 o. pFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL
/ X# m) G/ _. }9 W& j; VPenicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL , ?1 _% c7 D5 f/ M
Glutamine（谷氨酰胺） 2 mL 0 S& S% C/ f; t( G
Insulin（胰岛素） 200μL $ b. T1 t1 [& q) t+ K) C$ j
IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） 200μL , A" u7 w' Z7 N9 I' R
Indomethacin（吲哚镁锌） 200μL 0 q9 S. ^6 ]. _3 u5 ?
Dexamethasone（地塞米松） 200μL {# O7 h' _( g0 d# X
成脂分化诱导完全培养基B：
6 q, ?. @ j" Q. F1 ^成脂分化诱导基础培养基B 175 mL
9 j2 {: [% M. |5 t% NFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL 9 t, c0 y2 w* s, }& y
Penicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL # y- @7 }( e4 x1 h4 |4 E
Glutamine（谷氨酰胺） 2 mL 9 N0 e9 k, {9 s: \; @( G
Insulin（胰岛素） 200μL
/ o. `2 }" e3 ]
9 X- t, F3 v) h- ^5 W( d! kb)诱导分化： 1 G S4 ]. G. x4 j. Q- C
1)取P3代细胞，2×105/孔的密度接种到六孔板。
4 N9 a7 `6 R6 Q* d" @ i3 ~2)37℃，5%CO2培养。
; F5 l1 F( Z* D3 U9 `3)每隔 3 d换新鲜生长培养基至细胞完全汇合。 / F8 r1 O( a9 f6 a; ]! f
4)吸去上清培养液，每孔加入 2ml 的成脂分化诱导完全培养基A。 # O T2 B7 J. O8 N/ u( }+ u% d) I
5)三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基 B。
- y& B5 `* m( b6 u. Y2 I( C5 V5 D/ K$ K6)24 h后，再换回成脂分化诱导完全培养基 A 进行诱导。 6 t' J" Z/ M1 b1 l3 t
7)循环 3～5 次后，用培养基 B维持 7 d，每三天进行换液。
& ?' t! i' u3 k3 P! F; V" P8)分化诱导3 周后，固定细胞并用油红O进行染色。$ C. X+ ^0 e' r0 f M( l
8 G. F4 P- X/ M1 Vc)油红O染色 . x" R5 Q: G1 W' A7 Y
1)去除诱导培养基，PBS 洗两次。4%中性甲醛固定 30 min。 , |7 c$ {3 s% f6 r
2)吸去固定液，PBS 洗两次。每孔加入 1ml 的油红O染色 30 min。 ) z5 X9 Z+ j2 a/ i
3)去除染色液，并用PBS 洗两次。拍照。* V4 f! C* j6 E; N- r% v
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发表于 2011-5-3 14:26
发表于 2011-5-3 14:51
