流式细胞术检测项目解读

我是丁香

流式细胞术（flow cytometer,FCM）是我院免疫缺陷病研究与特殊实验中心开展的一项细胞免疫功能评价新技术，它可通过对人体外周血中成熟淋巴细胞各亚群的分析来判定机体的免疫功能状态，对疾病的诊断、预后及指导治疗有着重要意义。
4 O* e& q. Y' ?* w! J* P+ f将来自不同实验室的能识别同一种分化抗原的单抗归为一个分化群，简称CD（cluster of differentiation），CD后的序号代表一个（或一类）分化抗原分子。人的CD已从CD1命名至CD339，大致划分为T细胞、B细胞、髓样细胞、NK细胞、血小板、黏附分子、内皮细胞、细胞因子受体、非谱系、碳水化合物、DC、干细胞/组细胞、基质细胞和红细胞等14个组，这些分化抗原在免疫应答的识别、活化及效应阶段均发挥重要作用。
; I1 D9 p3 D0 u2 PFCM是一种集激光技术、光电技术、电子计算机技术以及细胞荧光化学技术和单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，FCM就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，即通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，将488nm或其它波长的光变为另一波长的光，并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算机统计处理变为可读数据。FCM可在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征，故具有特异性强，灵敏度高、速度快，并能实现多参数分析等优点。应用FCM可检测外周血、骨髓、精液、细针穿刺液、洗脱液、实体组织等多种类样本，明显提高了临床实验检测技术和诊断水平。
( |( F: Y  a+ l9 G3 E5 Q& l2 e& mFCM已在生命科学领域得到了广泛应用，对疾病的早期诊断、指导治疗及病情观察有着重要意义。目前FCM在临床中主要用于以下几个方面：  
) o7 Z* ^9 S7 {( }0 e    ●评价机体免疫功能：对原发性或继发性免疫缺陷、外科手术、肿瘤病人放、化疗前后及年老体弱、反复发热者机体免疫状况的评价。4 v  Z4 p0 S( C0 X. P. }
●感染性疾病的诊断及治疗效果观察：例如乙型肝炎病毒、爱滋病等。T淋巴细胞各亚群的变化能够敏感地反映感染状态，是了解免疫系统被病毒破坏程度的指标。
, Y0 D% Z" s# c  r) P: v●肿瘤学中的应用：机体免疫功能在恶性肿瘤患者均有不同程度的损害，对肿瘤的发生、发展、疗效及预后有直接影响。应用FCM对肿瘤早期诊断、疗效观察、预后评估有重要临床意义。
* B' q8 i3 c! C0 d●骨科的应用：HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎等骨、关节疾病有高度相关性。用FCM检测HLA-B27有助于此类疾病的诊断。
% b0 b( k3 I. i) H9 |, S●在血液学中的应用：血细胞在正常分化成熟过程中，细胞表面抗原也不断发生变化，每个阶段有其特异表达，检测血细胞不同分化阶段出现的细胞表面抗原有助于白血病的诊断和免疫分型。' j& T" M& L5 x" f
●在器官移植中的应用：活化T细胞的检测对移植后抗排斥治疗有指导作用。1 P5 T6 r5 T: G# {( A: @
●血栓与出血性疾病中的应用：检测血小板膜糖蛋白的表达是评价血小板功能的一种新手段，测定活化血小板可对血栓与出血性疾病的诊断提供依据。
9 |; Q) M% c$ v1 E1 d% I! M) _/ q; a●其他：流式细胞术还可应用于糖尿病、脑血管意外、脑创伤、呼吸道感染、肺心病、冠心病、肾炎、皮肤病、妇科病等多种疾病的诊断及病情观察。
( ^% a+ K9 x1 f结合我院实际情况，暂开展以下十项流式检测项目，具体如下：. @' R0 H. V3 ?/ D8 m5 [3 \8 s
1、        T淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8）5 f) G) l( W& F3 M) N: l
CD3：代表全部T淋巴细胞。
2 {7 X, n& j* p8 `  U' B4 g0 }7 o      CD3+T细胞增高见于自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、慢性活动性肝炎和移植排斥反应等。
( ]* M$ ~+ T1 O1 G1 O      CD3+T细胞减少，常见于某些白血病、应用免疫抑制剂、放疗过程中、先天性细胞免疫缺陷、艾滋病、多发性骨髓瘤、传染性单核细胞增多症等。
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CD4： 代表辅助性T细胞和迟发型超敏T细胞。 能促进B细胞、T细胞和其他免疫细胞的增值分化，协调免疫细胞间相互作用。
/ c( y; T% ]( [* x       CD4+T细胞下降，常见于恶性肿瘤和某些病毒感染性疾病（如艾滋病、巨细胞病毒感染）、严重创伤、全身麻醉、大手术、应用免疫抑制剂（如环抱霉素A）等；而类风湿关节炎活动期CD4+T细胞则增高。/ O: B% w+ E3 R4 |( f
CD8：代表抑制性T细胞和杀伤性T细胞。前者为调节性T细胞，后者主要识别存在于靶细胞表面上的MHC-I类分子与抗原结合的复合物,如被感染的靶细胞或癌细胞等，因此与抗病毒、抗肿瘤免疫有关。
1 K. c# O! G  nCD8+T细胞下降，常见于类风湿关节炎、干燥综合征、重症肌无力、胰岛素依赖性糖尿病以及膜型肾小球肾炎等；而感染性单核细胞增多症急性期、巨细胞病毒感染以及慢性乙型肝炎，CD8+T细胞常升高。5 L, {- V1 [( b
CD4/CD8：比值升高见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎、自身免疫性贫血、重症肌无力等。5 O" Y) y) G2 g5 ~% m$ ^; R( r
比值降低见于：(1)免疫功能缺陷如艾滋病等；（2）病毒感染，如慢性活动性肝炎和活动性肝硬化；（3）肿瘤病人CD3、CD4、NK细胞明显减少，CD8细胞明显增加，细胞免疫功能处于抑制状态，对识别和杀伤突变细胞的能力下降，利于肿瘤生长和转移。
5 W* W0 o8 @! @CD4+/CD8+比值＞2.5表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自体免疫反应；CD4+／CD8+＜1．4一般被称为“免疫抑制”状态，常见于（1）免疫缺陷病，如艾滋病患者的比值常小于0.5；（2）恶性肿瘤；（3）再生障碍性贫血、白血病；（4）某些病毒感染；（5）自体免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等的活动期。$ w  d2 `0 _1 L# P8 j
2、T淋巴细胞亚群绝对计数（CD3/CD4/CD8 TruC）
8 _3 _( z% C, K& M+ g. [, r除了可知道T细胞亚群项目中各亚群的百分数外，还可检测这些亚群的绝对值，辅助诊断和监测某些免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾病，而且CD4＋细胞的绝对计数也是AIDS的诊断标准之一，较百分含量的测定更具意义。
. b; R0 K/ O+ `, vCD3+CD4+ ：辅助性淋巴细胞（Th）
$ H# X$ {! [0 n/ `! YCD3+CD8+ ：抑制性淋巴细胞（Ts）( H3 W3 X4 H& Y( O4 @
CD3+CD4+/ CD3+CD8+：Th/Ts4 C* U( V& @$ a- r1 V+ S( N
Th/Ts比值下降常见于：免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5；使用免疫抑制剂；恶性肿瘤；再生障碍性贫血，某些血液病；系统性红斑狼疮；某些感染。# \9 p7 q2 k% i8 t* ^0 ]
Th/Ts比值升高常见于：自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎等。在同种异体器官移植以后，肾功能稳定的患者可出现Th淋巴细胞下降，Ts细胞上升，使Th/Ts的比值趋于正常。在自身骨髓移植后表型重塑期间可有Th/Ts比值下降。
* T- {! f' e" J! M% Z( \3、细胞免疫功能（T/B/NK）
/ y8 I8 {) Y: ?0 r6 \淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的一大细胞群，根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可以分成三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞（NK），各亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱。3 h4 L$ |; s& O7 V
⑴ T淋巴细胞是胸腺依赖性淋巴细胞。T细胞执行特异性细胞免疫应答，并在人胸腺依赖性抗原(TD-Ag)诱导的体液免疫应答中发挥重要作用。# z. X! }- k0 T) l8 C
T淋巴细胞上升多见于：慢性活动性肝炎或慢性迁移性肝炎；器官移植排斥反应；重症肌无力；甲亢与甲状腺炎患者；何杰金病。
: d3 x6 E6 J9 ]9 }% [/ J: jT淋巴细胞下降多见于：恶性肿瘤；自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎；继发性免疫缺陷病，如艾滋病；接受放疗、化疗或使用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂患者。
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⑵ B淋巴细胞：（CD3－/CD19＋）
1 ]: x  Y4 v4 o' D  sB淋巴细胞是抗体产生细胞，发生并成熟于骨髓，占外周血淋巴细胞的10%-15%，骨髓中的淋巴细胞主要为B淋巴细胞，是介导特异性体液免疫应答的细胞。4 H6 u" p' k* x8 ]
B淋巴细胞上升多见于：多发性骨髓瘤；聚球蛋白血症；淋巴瘤；艾滋病。
: r! T8 `- N+ |  |& P& L4 mB淋巴细胞下降多见于: 原发性免疫缺陷病，如性联无丙种球蛋白血症等恶性肿瘤。
2 E$ j) G; i, I. ~+ j7 s⑶  NK细胞：（CD3-/CD16+/CD56+）8 M- m7 i- d; h7 J
NK细胞是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞，主要分布于外周血和脾脏；NK细胞不表达特异性抗原识别受体，无需抗原预先作用，就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的细胞，即对肿瘤细胞及其它靶细胞具有非特异的杀伤力，因此在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。该种淋巴样细胞约占外周血淋巴细胞的10%。NK细胞活化后还可分泌INF-γ和TNF-α等细胞因子，产生免疫调节作用。
3 K2 U/ e( b4 JNK细胞增加常见于：某些病毒感染性疾病的早期；长期使用干扰素的诱导物；骨髓移植后；习惯性流产。
5 V6 Y4 U- q3 j" ]# rNK细胞下降常见于：恶性肿瘤，特别是中晚期或伴有转移的肿瘤；免疫缺陷病及使用肾上腺激素等免疫抑制剂；部分病毒感染、细菌感染及真菌感染；某些白血病前期。. r  W+ F+ d; ^$ H
4、调节性T细胞（CD4/CD25）
! C$ S- [9 E; c, y2 h9 ?1 b调节性T细胞（Tr）是维持机体免疫耐受的重要因素之一，即其细胞对抗自身免疫，帮助机体抵抗重复性感染，保护肠道的正常菌群，并有助于维持怀孕。其负面作用是支持了肿瘤细胞免受免疫系统的攻击。自然形成的调节性T细胞占CD4+ 群体的5-10%，最早可见于T淋巴细胞发育的第一阶段。
2 ?5 M  q& c9 ^. A' Y6 X) VTr细胞数量减少或者功能异常：可能导致自身免疫病的发生。2 Y; u& H6 a! A& H2 r/ b
Tr细胞数量增加：慢性重症乙肝患者PBMC和肝脏淋巴细胞Tr数显著升高；急性乙肝病人外周血Tr数量起初下降，随着病情的恢复，其数量有上升的趋势；肝癌病人Tr数量增多预后较差。
! T- T9 k& t2 `+ o5、总活化/活化/早期活化T细胞亚群
* E' l$ i, Q2 t+ X* r+ b活化淋巴细胞的标志有CD25、CD69、CD71、CD38、CD95、HLA-DR。它们在T细胞活化的不同时期表达。具体见下图：
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4 {/ a5 m0 a6 n/ p5 T6、诱导性/幼稚性/记忆性T细胞
$ l2 {( v( d" x! a8 dT细胞依据功能与表型分为幼稚性和记忆性T细胞。幼稚性T细胞高表达CD45RA和CD62L。记忆性T细胞表达CD45RO,而CD45RA一般不表达。
& s. L7 _' b- r$ ~辅助性T细胞中的幼稚性(Naive)T细胞亚群：CD4+CD45RA+T细胞，幼稚性T细胞即按白细胞表面分化抗原CD45将CD4+T细胞亚群进行分类的CD4+CD45RA+T细胞起一定的抑制作用，被视为CD4+T细胞中的负向平衡成分；记忆性T细胞亚群：CD4+CD45RO+T细胞是经过抗原刺激后活化的记忆性T细胞，它在细胞因子分泌及对B细胞辅助方面与CD4+CD45RA+T细胞有差异。CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+两组亚群是CD4+T细胞发挥调节作用的一对平衡因素，它们在B细胞产生免疫球蛋白过程中，分别从促进和抑制促进两方面进行控制使特异性免疫球蛋白的产生恰到好处。
: T/ T- w6 B" P. w. O% |在活动性多发性硬化症中，CD4+CD45RA+的亚群选择性丢失，CD45RA表达在部分T细胞上、所有B细胞、NK细胞上。
0 Q4 i  n0 M8 K0 q" }  z: o: l0 C许多变态反应性疾病病人外周血中CD4+CD45RA+T细胞所占比例高于正常人。
" n2 W, v/ u5 YCD45RO+记忆性T细胞在某些病毒感染性疾病处于进展期时它的数量增加，当接受抗病毒治疗后其数量又会下降。CD45RO表达在约40％静止的外周血T细胞，包括CD4+T、CD8＋T细胞亚群，也表达在大多数胸腺细胞、活化的T细胞、单核细胞、巨嗜细胞、粒细胞上。; \; E& I# m! R. M
7、辅助性T细胞（CD4/CD29/CD3）7 ], C0 O4 H! d: T* J
辅助性T细胞（TH细胞）接触到抗原以后就会分化为效应细胞，分泌出高水平的干扰素-γ、白介素-4（IL-4）、IL-10以及其它免疫调节因子。初始TH细胞在免疫反应中能够分化成至少两群功能细胞--TH1细胞：分泌干扰素-γ（IFN-γ）和TH2细胞：分泌白介素-4（IL-4）。因此，我们把IFN-γ和IL-4作为效应细胞因子。TH1细胞主要作用于细胞免疫，而TH2细胞与细胞外免疫反应有关。* I2 V3 W& b! O& b7 z* h9 `% n5 u
8、HLA-B271 Z" J5 I& A6 x' J& {$ T8 F: s) q
HLA-B27在淋巴细胞的表面有丰富的含量，早在二十多年前人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90％的强直性脊椎炎患者HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5~10％的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要的意义。0 N( m! {5 J( ~( z
以下是HLA-B27抗原的表达在脊椎性关节炎病中相关性：
, ~! Z5 h& Y" Z1 h) B9 A强直性脊椎炎：HLA-B27阳性率为＞90％: d# ]4 @& x# \& N6 t
Reiter's综合症：HLA-B27阳性率为79~90％
0 l7 m8 [0 X; l% n" u银屑病性关节炎：HLA-B27阳性率为50~60％
* I  T1 m6 k- Y  }葡萄膜炎（眼色素层炎）：HLA-B27阳性率为40~50％; T2 @7 c! q; e; ]. z
溃疡性结肠炎伴有关节病：HLA-B27阳性率为5~10％+ Z9 t$ G1 r0 f- a2 t
因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。/ k6 f0 [( L1 j6 Q3 r; j
9、DNA倍体分析' s' g2 \8 Z* s& a/ @
用FCM分析大量细胞的细胞周期和DNA倍体已成为一种日益重要的肿瘤研究方法，并已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中，为肿瘤的诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。
) W& W7 q3 K% B" N1 m在细胞周期（G0,G1,S,G2,M）的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化，整个复制周期可以描述为G0／G1, S，G2／M        期。通过核酸染料标记DNA，并由FCM进行分析，可以得到细胞的各个时期的分布状态，计算出G0／G1％, S％，G2／M％，了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
- F$ F+ l5 N, ~3 h' _DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌变的早期诊断。淋巴瘤在病理形态学还不能作出诊断前，FCM倍体分析可以提供准确的诊断信息。通常认为DNA含量高，非整倍体的肿瘤恶性程度高，预后差，二倍体或近二倍体肿瘤预后好。% k6 r( k! i' `* `3 k/ n
FCM分析诊断肿瘤细胞的标准：(1)发现DNA非整倍体细胞峰诊断为癌。(2)如无明显的非整倍体细胞峰，但有一个突出的四倍体细胞峰和>15%的超二倍体细胞（S期细胞），并伴有G0/G1峰的CV >9%，诊断为癌。(3)无明显的非整倍体细胞峰，但G0/G1峰CV值增大，并伴有>10%~15%超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。
& v8 l8 s7 w0 |' I+ n& H( s应该注意的是：只有在染色体数目的变化带来的DNA含量差异可被检测时，才可能由DNA异倍体的检出，因此DNA含量的不异常不能除外恶性或染色体异常的存在；另外，正常细胞在衰老过程中的多倍体化以及肿瘤治疗后导致的DNA含量的增加、凋亡和坏死导致的DNA含量降低都是在分析DNA直方图时需要考虑的因素。0 o+ S, S" o* y: }9 t# ?' f  J
DNA检测的常用术语：
5 }" H: R# `! a- d3 L: n! A8 L- iCV（变异系数）：DNA直方图中峰的CV越低，质量越好，从图中可能获得的信息越多。新鲜标本的CV常比石蜡包埋的标本好，新鲜标本的CV常＜3％，而石蜡包埋的标本CV则取决于组织病理实验室的具体操作方法，通常可得到＜＝5％。当G1峰的CV＝＞8％时，不再适合估计S期比例。2 J  D! ~/ j+ U
DI（DNA指数）：指肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1意味着二倍体（2c）。: {- H/ F$ M6 x% P9 o5 a5 h' v) i8 G
Ploidy（倍体）：原指染色体数目，流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常的DNA含量但不除外染色体异常。        DI为1.9－2.1的细胞为四倍体（CV为5％时），在二倍体和四倍体区域之外的统称异倍体。
+ K% M  J; y! a' W; T1 e( U10、细胞凋亡分析
) u" |3 N% i+ Z9 M0 S细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是指为维持机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡。细胞凋亡的作用：清除无功能细胞、调控细胞数量、清除病态的或有害的细胞、清除多余细胞。' s  P  X& ^3 V; G* \+ v1 j' {2 V
Annexin V/PI法是目前检测细胞凋亡和区分坏死细胞特异性较强的方法，其原理是正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸定位于细胞膜的内侧。在细胞凋亡的早期，由于细胞膜失去对称性，磷脂酰丝氨酸从胞膜内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力，可特异性的与磷脂酰丝氨酸结合。凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，碘化丙啶（PI）不能进入细胞内，而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞可同时被Annexin V-FITC和PI染色。利用FCM进行双参数分析，即可将凋亡细胞（Annexin V + ）与继发坏死的细胞（Annexin V + PI + ）区分开来，并能计算出阳性细胞的百分率。
: q( C+ M7 o4 T# m综上所述,我们认为Annexin V/PI法既可检测早期凋亡，又可将凋亡及死亡细胞区分开来，是目前FCM定量检测凋亡的首选方法。该方法测量结果准确，检测时间短，人为影响因素少，节约细胞样品用量，为细胞生物学、肿瘤学研究，尤其是细胞动力学研究提供了一种新的、更为实用的分析方法。
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