新手关于MEF的问题

skyjasonli

小弟终于动手了！不过问题也越来越多~~" ]7 u2 p* Z+ Q, X# h% d
昨天取了胚胎，13。5天的，有这么几个问题：  j& C# l% i8 p' F& F
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1,10个胚胎，分离MEF之后到5个10cm dish，今天早上过来看就已经全铺满了。我看几个protocol都说是2-3个胚胎一个dish，2-4天才能长满呀。是我铺的太多了？
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2，昨天消化的时候还是有一些组织块没有完全消化，也没过筛、离心，直接铺板了。今天看到板上有一些组织块，这个会随着传代消化两次之后就没有了吗？. X, X1 {: |( R: [, G

1 p  b! f# I" [2 T8 y3，P1代MEF是什么时候？是分离之后的细胞？还是第一次传代之后的细胞？我看一个上海生科院的protocol说的第一次传代之后的，但这样的话那岂不是一只母鼠就可以产生很多P3代MEF？5 K( n# L* @1 G
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望各位前辈不吝赐教~谢谢~

sheepthief

这些问题都可以回答，呵呵。
$ f& e% v4 n$ v6 L8 M! G' m* h% {1、你确实铺的满了点，一般1.5到2个胚胎铺一个75平方厘米的培养瓶，不要到3个胚胎的，而且2-4天长满的protocol你是在哪里看到的？我做的都是第二天就能够长满的: e$ y; T8 L7 o& t/ ^6 O% A
2、组织块是会随着传代逐渐清除掉的，但是最好下次再做的时候尽量消化完全，过滤似乎没有太大的必要。
. K! t3 q9 ~7 y) J3、P1就是你把胚胎消化了得到的MEF，这个阶段的就是P1，不是第一次传代后的。

c5nc5n

1.13.5的胚胎比较大，你取的可能多一点，我一般是12，5天取的，2个胚胎放一个10dish
4 j$ U* Z+ `! ]% I( B2 y( M2.用pbs洗一遍或者放管里沉一下就好了。* ]. Z+ m# r) E( k! E' \0 I/ j) j
3.P1就是当你把这次做的解冻之后再长满的时候就是P1

sunny2829

关于代次，我看有些实验室把取出胚胎分离到dish上，为P0的耶，传代后称为P1。* I  Z" @, |: t4 T
至于传到几个dish上，要看胚胎的大小而定，一般2个胚胎一个dish，如你的情况是密了点，那下次10个胚胎尝试6-7个dish呗。不过稀的话，MEF反而长得不好。
" e9 Y8 h# B4 c9 T& I1 L消化的小团块可以不用管，随着传代会被消化的。太大的话，直接吸走就好了~~~~

hygene

' w2 Y' T# H) B% m1 T- B. H, m$ m/ u8 x+ P3 ^/ F/ J2 \2 s
1、10个胚胎，分离MEF之后到5个10cm dish，今天早上过来看就已经全铺满了。我看几个protocol都说是2-3个胚胎一个dish，2-4天才能长满呀。是我铺的太多了？6 \3 ?. z7 j; i, u# X
能长满就Ok，我以前做的时候铺的比较稀，基本上是1个胚胎一个100m2的培养瓶，一般2~3天长满。- |8 u, V4 h$ ]$ J2 E! O, d1 ?
2、昨天消化的时候还是有一些组织块没有完全消化，也没过筛、离心，直接铺板了。今天看到板上有一些组织块，这个会随着传代消化两次之后就没有了吗？- [/ y, s9 l+ Y, a( [. r( J$ @
未贴壁或贴壁不牢的组织块换液的时候就会被倒（吸）掉（或者洗掉），贴着的消化传代2~3次也会消失的。
5 O8 q1 m( t. o1 L9 ~$ E/ |+ m3，P1代MEF是什么时候？是分离之后的细胞？还是第一次传代之后的细胞？我看一个上海生科院的protocol说的第一次传代之后的，但这样的话那岂不是一只母鼠就可以产生很多P3代MEF？"
9 }, l/ K" M* N8 R: n$ _1 k刚做的是原代，即P0代，P1代MEF是传1代后的。一只母鼠确实可以产生很多P3代MEF。

skyjasonli

ok~非常感谢各位的解答！
2 u/ y; d8 Q/ c7 F/ Z- K4 c刚做了支原体检测，么有支原体！% R2 k2 _4 @( p3 [, o
现在就是看着细胞形态不像网上看到的那么漂亮，可能是太密了~马上给传代！& ?" D# P) g- j8 t  G% c  [" J
但愿一次成功吧~怀着孩子的小白鼠，真不忍下手~哈哈

sheepthief

回复 skyjasonli 的帖子. |% w! w' `. |0 a& |. m4 }
, z2 D5 K4 X8 Q# B3 p) P4 R
你是怎么做的支原体检测呢？

skyjasonli

回复 sheepthief 的帖子) Q+ M) [0 R# w

+ A2 `1 Y( A$ m, S巢式pcr检测，用的是版上有位兄台的protocol~你可以找找！

czzhaozhu

1. 根据个人经验，一般取13.5天的胚胎最合适，如果取12-13天的胚胎太小，获得的细胞就会很少；如果取15-16天的，细胞又会老，增殖能力有限，分泌的因子也会很少。至于接种密度，10个胚胎一般接种约15个100mm皿，第二天换液，第三天就能长满。; t% T% d5 ]+ A0 P" d$ v) V
2.如果分离原代时没有过筛，组织块就比较多，细胞较杂，清洗或传代后那些组织块就减少了，随着传代细胞也会变得单一。7 \$ R, E3 t) N# ?9 ?1 o
3. 我们认为刚分离的为原代P0 MEF，传代后为为P1。
$ N9 E' ?/ m) X4. 个人认为用支原体检测的试剂盒，要比PCR的方法更为可靠。