新手关于MEF的问题

skyjasonli

小弟终于动手了！不过问题也越来越多~~4 l2 z0 o/ z% v# L. r- ^
昨天取了胚胎，13。5天的，有这么几个问题：. p) Q+ Y3 J  r) b; I. O6 F
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1,10个胚胎，分离MEF之后到5个10cm dish，今天早上过来看就已经全铺满了。我看几个protocol都说是2-3个胚胎一个dish，2-4天才能长满呀。是我铺的太多了？
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/ e& W# u8 ?  {4 p. |2 ?2 J4 T2，昨天消化的时候还是有一些组织块没有完全消化，也没过筛、离心，直接铺板了。今天看到板上有一些组织块，这个会随着传代消化两次之后就没有了吗？
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4 J. F/ j4 L. a4 P3，P1代MEF是什么时候？是分离之后的细胞？还是第一次传代之后的细胞？我看一个上海生科院的protocol说的第一次传代之后的，但这样的话那岂不是一只母鼠就可以产生很多P3代MEF？2 j; w5 O6 H, N

+ G4 e0 h9 Q4 S7 X$ G望各位前辈不吝赐教~谢谢~

sheepthief

这些问题都可以回答，呵呵。4 M( g" w) [, a" c7 [5 z) l
1、你确实铺的满了点，一般1.5到2个胚胎铺一个75平方厘米的培养瓶，不要到3个胚胎的，而且2-4天长满的protocol你是在哪里看到的？我做的都是第二天就能够长满的
. L7 ?( x4 Y$ ~8 D: B: W2、组织块是会随着传代逐渐清除掉的，但是最好下次再做的时候尽量消化完全，过滤似乎没有太大的必要。( Z7 X4 {% ^6 [( G
3、P1就是你把胚胎消化了得到的MEF，这个阶段的就是P1，不是第一次传代后的。

c5nc5n

1.13.5的胚胎比较大，你取的可能多一点，我一般是12，5天取的，2个胚胎放一个10dish( D9 f; A! S7 e+ h
2.用pbs洗一遍或者放管里沉一下就好了。- t- q7 R/ t1 F1 F  n& R
3.P1就是当你把这次做的解冻之后再长满的时候就是P1

sunny2829

关于代次，我看有些实验室把取出胚胎分离到dish上，为P0的耶，传代后称为P1。/ q3 H* h% J! p8 O4 Z5 U, j
至于传到几个dish上，要看胚胎的大小而定，一般2个胚胎一个dish，如你的情况是密了点，那下次10个胚胎尝试6-7个dish呗。不过稀的话，MEF反而长得不好。
; O* e; c3 X. ^8 t$ O% L% `消化的小团块可以不用管，随着传代会被消化的。太大的话，直接吸走就好了~~~~

hygene

' ^( B& J+ c8 R, v! M. k% h. N2 H# V$ u4 u) j
1、10个胚胎，分离MEF之后到5个10cm dish，今天早上过来看就已经全铺满了。我看几个protocol都说是2-3个胚胎一个dish，2-4天才能长满呀。是我铺的太多了？2 c+ L+ v* i! J7 Y  f
能长满就Ok，我以前做的时候铺的比较稀，基本上是1个胚胎一个100m2的培养瓶，一般2~3天长满。
* I. f! u. I& T9 F6 g: g2、昨天消化的时候还是有一些组织块没有完全消化，也没过筛、离心，直接铺板了。今天看到板上有一些组织块，这个会随着传代消化两次之后就没有了吗？
, o4 G% d/ K/ d2 r7 d未贴壁或贴壁不牢的组织块换液的时候就会被倒（吸）掉（或者洗掉），贴着的消化传代2~3次也会消失的。
" f$ G2 u' C) o; }& S+ O3，P1代MEF是什么时候？是分离之后的细胞？还是第一次传代之后的细胞？我看一个上海生科院的protocol说的第一次传代之后的，但这样的话那岂不是一只母鼠就可以产生很多P3代MEF？" # d+ e6 S$ n$ E7 {1 i! [0 z. f, T
刚做的是原代，即P0代，P1代MEF是传1代后的。一只母鼠确实可以产生很多P3代MEF。

skyjasonli

ok~非常感谢各位的解答！
7 F) z1 A7 E: _6 H8 b) i刚做了支原体检测，么有支原体！
: L# x( z' H& ^; z% z; W8 ~* Q7 T( W& e现在就是看着细胞形态不像网上看到的那么漂亮，可能是太密了~马上给传代！
6 H7 [/ h! i2 E" I但愿一次成功吧~怀着孩子的小白鼠，真不忍下手~哈哈

sheepthief

回复 skyjasonli 的帖子6 o" x! e. u6 |6 Q- t! p* s" H
7 [9 k6 ]$ i7 M) X* a, w+ Q! m
你是怎么做的支原体检测呢？

skyjasonli

回复 sheepthief 的帖子1 s: ~* B4 y- d, m4 _2 O
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巢式pcr检测，用的是版上有位兄台的protocol~你可以找找！

czzhaozhu

1. 根据个人经验，一般取13.5天的胚胎最合适，如果取12-13天的胚胎太小，获得的细胞就会很少；如果取15-16天的，细胞又会老，增殖能力有限，分泌的因子也会很少。至于接种密度，10个胚胎一般接种约15个100mm皿，第二天换液，第三天就能长满。. g) ~1 w* |8 M: p  X: J7 [6 U
2.如果分离原代时没有过筛，组织块就比较多，细胞较杂，清洗或传代后那些组织块就减少了，随着传代细胞也会变得单一。
$ G/ ^) p8 a2 x& j9 |' ?6 V( l3. 我们认为刚分离的为原代P0 MEF，传代后为为P1。! ~) i) `" y) Q' Z; X8 U; |
4. 个人认为用支原体检测的试剂盒，要比PCR的方法更为可靠。