骨髓干细胞就鉴定 有图

骨道边

软骨出来了，可是骨髓基质干细胞长的还不行，现在我都不知道是不是干细胞了。让我一个做成骨细胞的师姐看了一下她说是成骨，让做软骨的师兄看他说是软骨。搞得我都很晕了。希望大侠们指点。现在简单把我的整个过程跟大家说一遍，有什么不足的请指正。
# ^$ O% I3 [: {2 q  1.取160-180g的SD大鼠一只，用3%戊巴比妥钠1.5ml（致死量）麻醉，拨皮，手术器械取下整个下肢，需要软骨的话注意不要把股骨头关节面破坏了。75%酒精泡15分钟移入超净台。
. I8 w) l+ f6 P+ Q1 z  2。用pbs漂洗两遍以上，在一次性培养皿中剃掉多余的软组织，剃的越干净越好。
& q3 j% S1 J- N! d; z# N3 V  3，移入另一个培养皿，倒上点pbs，用手术刀削下股骨头上的软骨，注意不要削到软骨下骨，还有把半月板也取下来，剪碎。收集到离心管中胰蛋白酶37度摇床中消化10分钟后弃上清，加入二型胶原酶在培养箱中消化，分别于24h和48h分两批收集软骨细胞。（如果补需要软骨的战友们可不用这一步）7 N5 `2 m, T( c' \4 T
  4，用止血钳固定已经分离好的股骨和胫骨，用咬骨钳要掉两端。此时需要一个新的培养皿加入新鲜的α-MEM10ml左右，用10ml的注射器吸取培养液来冲洗骨髓到培养皿中，反复冲洗3次以上，剩下的骨头都这样处理，冲下来后在用吸管来充分吹打匀悬浮细胞。
4 g4 Y8 f! r/ {. S  5，将混悬液移入培养瓶中放到培养箱中培养
+ S7 L; y  [5 g/ ?* ?  6，前三天不去看它，也不要过多的打开培养箱6 w) m' X. {1 C! S4 v4 n" J
  7，第四天给予办换量换液
) X" a4 s3 y: \, j  D  8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质
  X4 @8 ?+ S9 [) _. K- _, f  9，接下来就是换液，看细胞的生长状态5 s+ R9 s  W! b# H6 P

% n7 r: F1 p/ r5 b: a( V9 E& K以上就是我的整个实验步骤，结果是我的细胞是长出来点了，可是瓶底的杂质较多，所以我每次换液的时候都要把pbs灌满培养瓶用吸管吹打瓶底，只要是贴住的细胞不会被吹下来的这可以放心，如果挂到就不敢保证了。可是那些杂质和细胞碎片很难被吹下来。所以我的细胞没有长成一大片而是散在的小团伙。
& j: k0 v* r5 K6 F7 X5 G4 y  我是5月20号做的，到今天拍的片子，请大家看看给我鉴定一下是不是干细胞，下一步该怎么办，是传代还是直接传到六孔板中爬片鉴定啊。

骨道边

那你那里有干细胞的形态的图片吗，我也不知道什么时候才长得确实像干细胞啊，呵呵

liuerfu

我看别人提的干细胞也只是形态上大致管擦一下，只是在细胞确实长得像msc时才用流式细胞仪检测。

liuerfu

我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨
' ^( e$ O# g, n* ~你可以用鉴定软骨的方法鉴定一下，看是不是软骨细胞

骨道边

好的，希望它能长起来了，今天以看1号传代的软骨细胞长的真是疯狂啊，都长满了，我赶紧给冻存了，可是今天师姐感冒了不来科里，老板这两天都不在，不知道又上哪里旅游去了，只能自己来了。你冻存过么？有什么注意的地方跟小弟我说一下啊。谢了

ytumuyangren

看着形态和我刚开始养的软骨有些像，刚开始我同学以为是纤维细胞呢，但是老板说软骨细胞没长起来之前也会是长梭形的，因为他们都是来自中胚层的分化。所以不能单纯的就形态说明是什么细胞，养养看吧，祝你好运。呵呵！

临床干细胞

我觉得挺像，应该是干细胞没问题

taxuewuge

我取原代是用离心法，得到的细胞相对较纯。所以分离后第三天就进行半换液。如果细胞5天还不贴壁的话基本上以后也贴不了。第二天就把不贴壁的细胞冲干净，就会让一些贴壁较慢的细胞无法贴壁，那样瓶子里贴壁的细胞太少，达不到一定的密度，细胞就会长不起来，而且传代以后细胞的量就更少，根本无法长满瓶底。我养细胞才一个月，以上只是我的拙见，仅供参考，有不对的地方请多多指教。

骨道边

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1 H/ v' s; b/ F5 R6 t! K1 z0 r& ~# W( T6 ~$ T3 \4 q) L
好的，我做的就是原代的，步骤就是我说的那样，没有离心。再看看，不行那就重做了。我这次的问题是不是第一次换液的时间间隔有点长也有关系啊？两天就第一换液的话是不是就可以吧那些不贴壁的细胞冲的干净点，瓶底也干净点细胞好长？谢谢指导

taxuewuge

上图是原代的图吗？我做的原代数量比你的多，基本上贴满培养瓶的80%才传代的，我做原代用的是全骨髓离心法，得到的细胞相对纯，而且我是把鼠的肱骨和股骨的骨髓全用D-Hank's液冲出来的，所以离心后得到的细胞数量较多。如果上图是原代的话，我觉得细胞量太少了，传代可能会导致密度太小，细胞长不起来，建议在培养一段时间。注意细胞都有一定的生长周期，时间长了，细胞就会衰老，所以一定要注意观察细胞的形态。如果培养后不行的话，就重做吧。