骨髓干细胞就鉴定 有图

骨道边

软骨出来了，可是骨髓基质干细胞长的还不行，现在我都不知道是不是干细胞了。让我一个做成骨细胞的师姐看了一下她说是成骨，让做软骨的师兄看他说是软骨。搞得我都很晕了。希望大侠们指点。现在简单把我的整个过程跟大家说一遍，有什么不足的请指正。
9 E& W# v* H7 r; [& U. W2 P2 z  1.取160-180g的SD大鼠一只，用3%戊巴比妥钠1.5ml（致死量）麻醉，拨皮，手术器械取下整个下肢，需要软骨的话注意不要把股骨头关节面破坏了。75%酒精泡15分钟移入超净台。
) f) v1 A  V& X; @! Y+ v  2。用pbs漂洗两遍以上，在一次性培养皿中剃掉多余的软组织，剃的越干净越好。; x' ?5 D/ e! h  K+ ?2 B" [
  3，移入另一个培养皿，倒上点pbs，用手术刀削下股骨头上的软骨，注意不要削到软骨下骨，还有把半月板也取下来，剪碎。收集到离心管中胰蛋白酶37度摇床中消化10分钟后弃上清，加入二型胶原酶在培养箱中消化，分别于24h和48h分两批收集软骨细胞。（如果补需要软骨的战友们可不用这一步）, S  A9 p! f$ L
  4，用止血钳固定已经分离好的股骨和胫骨，用咬骨钳要掉两端。此时需要一个新的培养皿加入新鲜的α-MEM10ml左右，用10ml的注射器吸取培养液来冲洗骨髓到培养皿中，反复冲洗3次以上，剩下的骨头都这样处理，冲下来后在用吸管来充分吹打匀悬浮细胞。
$ z1 l9 Y, m2 z' m  5，将混悬液移入培养瓶中放到培养箱中培养, M( P( g: h3 u- {. \
  6，前三天不去看它，也不要过多的打开培养箱
/ x( ~7 N) ~; X" l# I) \& r9 h: G+ W  7，第四天给予办换量换液$ h% \8 j/ V! N5 h* V- L
  8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质& L8 V. z1 C2 q( {
  9，接下来就是换液，看细胞的生长状态
: z7 y  O3 Z* d9 A9 o7 {/ W6 K5 n9 w3 P# \3 p: P
以上就是我的整个实验步骤，结果是我的细胞是长出来点了，可是瓶底的杂质较多，所以我每次换液的时候都要把pbs灌满培养瓶用吸管吹打瓶底，只要是贴住的细胞不会被吹下来的这可以放心，如果挂到就不敢保证了。可是那些杂质和细胞碎片很难被吹下来。所以我的细胞没有长成一大片而是散在的小团伙。! u0 E3 B. o: N: Q
  我是5月20号做的，到今天拍的片子，请大家看看给我鉴定一下是不是干细胞，下一步该怎么办，是传代还是直接传到六孔板中爬片鉴定啊。

骨道边

骨道边

大图为40倍镜下，小的为20倍镜下

骨道边

* m$ ~( t1 ?, r+ m$ C2 d
% q# H/ n8 i* c. q: ^补充内容 (2011-6-1 18:57):5 R& y4 k# K0 S& S/ o; P
请大家不要责怪，第一次用上图请原谅。拍图也是第一次拍，这两张也是20倍镜下图片。

皮搋子

8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质&2 \. y6 c6 t1 t
$ d3 P/ d# V: t( [" t
这步貌似有问题吧，你说的杂质是什么？
, ^  a, Z3 @+ A- f7 D( g

tangyvhuang

有点像间充质干细胞，这密度还是养几天看看吧。步骤没什么问题，我觉得直接爬片鉴定吧，有时候形态不说明问题，也许你看着不像的细胞他就是呢。诱导一下呗

文武庙

个人也觉得仅凭形态难说明哪种细胞，如果能测表型神马的，还是上个流式啥滴比较好！

wenfeng8212

我觉得应该先纯化一下间充质干细胞吧。用4倍看一下细胞密度，细胞密度到80%左右，就传代。

骨道边

回复 皮搋子 的帖子2 T' N3 Q! i( j5 Y: X

+ w; n  Q2 ^( ^3 H" K# Q因为全换液量的时候好多细胞，本人觉的是血细胞吧，它也不长，冲也冲不掉，就是圆圆的。冲掉的那些细胞就留下了小点点。那些就是杂质吧- M8 t# \# Z7 _, I/ m9 _7 P- y

骨道边

回复 tangyvhuang 的帖子* W3 X6 }  g4 V, t. e* v! {

" H) z3 l$ e1 ^) A& L我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨，所以如果它不是干细胞的话就诱导不出来了。那先养一养吧。等它长多了传一传代，留点本钱，第一次养出来。呵呵。。。谢了，以后向你请教哦
) c6 n2 i# t: h