骨髓干细胞就鉴定 有图

骨道边

软骨出来了，可是骨髓基质干细胞长的还不行，现在我都不知道是不是干细胞了。让我一个做成骨细胞的师姐看了一下她说是成骨，让做软骨的师兄看他说是软骨。搞得我都很晕了。希望大侠们指点。现在简单把我的整个过程跟大家说一遍，有什么不足的请指正。
/ |# [8 W( s  ?  G  1.取160-180g的SD大鼠一只，用3%戊巴比妥钠1.5ml（致死量）麻醉，拨皮，手术器械取下整个下肢，需要软骨的话注意不要把股骨头关节面破坏了。75%酒精泡15分钟移入超净台。
8 n$ D4 s( @! Z4 n& s; d  2。用pbs漂洗两遍以上，在一次性培养皿中剃掉多余的软组织，剃的越干净越好。
- x$ y* E( h# Y5 ]) D7 A. z/ z  3，移入另一个培养皿，倒上点pbs，用手术刀削下股骨头上的软骨，注意不要削到软骨下骨，还有把半月板也取下来，剪碎。收集到离心管中胰蛋白酶37度摇床中消化10分钟后弃上清，加入二型胶原酶在培养箱中消化，分别于24h和48h分两批收集软骨细胞。（如果补需要软骨的战友们可不用这一步）  @+ N+ k8 ~% o2 y9 @
  4，用止血钳固定已经分离好的股骨和胫骨，用咬骨钳要掉两端。此时需要一个新的培养皿加入新鲜的α-MEM10ml左右，用10ml的注射器吸取培养液来冲洗骨髓到培养皿中，反复冲洗3次以上，剩下的骨头都这样处理，冲下来后在用吸管来充分吹打匀悬浮细胞。
' W- Y5 @3 Y; }/ }+ ]  a$ @. Q  5，将混悬液移入培养瓶中放到培养箱中培养: K6 ?# A( k/ P5 j! N5 n! P
  6，前三天不去看它，也不要过多的打开培养箱* U4 L- \& B% w( j5 L
  7，第四天给予办换量换液
8 e: V& B& F4 {" t! Q  8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质
5 A6 v4 `1 h9 D( v  9，接下来就是换液，看细胞的生长状态( r# E$ M( |# B

& `5 {& R; Q+ o' I  J* x以上就是我的整个实验步骤，结果是我的细胞是长出来点了，可是瓶底的杂质较多，所以我每次换液的时候都要把pbs灌满培养瓶用吸管吹打瓶底，只要是贴住的细胞不会被吹下来的这可以放心，如果挂到就不敢保证了。可是那些杂质和细胞碎片很难被吹下来。所以我的细胞没有长成一大片而是散在的小团伙。% h: W& S1 [# F
  我是5月20号做的，到今天拍的片子，请大家看看给我鉴定一下是不是干细胞，下一步该怎么办，是传代还是直接传到六孔板中爬片鉴定啊。

骨道边

骨道边

大图为40倍镜下，小的为20倍镜下

骨道边

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补充内容 (2011-6-1 18:57):8 H/ F; ~: O" |0 a$ f5 w
请大家不要责怪，第一次用上图请原谅。拍图也是第一次拍，这两张也是20倍镜下图片。

皮搋子

8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质&; |# A4 B  u6 }6 h9 _

, a+ Q1 S! c& w9 a6 ~) e/ x这步貌似有问题吧，你说的杂质是什么？0 p: k3 G+ q" q. e0 K$ S

tangyvhuang

有点像间充质干细胞，这密度还是养几天看看吧。步骤没什么问题，我觉得直接爬片鉴定吧，有时候形态不说明问题，也许你看着不像的细胞他就是呢。诱导一下呗

文武庙

个人也觉得仅凭形态难说明哪种细胞，如果能测表型神马的，还是上个流式啥滴比较好！

wenfeng8212

我觉得应该先纯化一下间充质干细胞吧。用4倍看一下细胞密度，细胞密度到80%左右，就传代。

骨道边

回复 皮搋子 的帖子# p: S+ n! M+ Q) m

3 g! A& ?8 U( E  c3 \因为全换液量的时候好多细胞，本人觉的是血细胞吧，它也不长，冲也冲不掉，就是圆圆的。冲掉的那些细胞就留下了小点点。那些就是杂质吧
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骨道边

回复 tangyvhuang 的帖子) q1 G: ~3 q/ u4 P. K$ F9 E1 l8 q

8 S4 }, g% [) Q7 B我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨，所以如果它不是干细胞的话就诱导不出来了。那先养一养吧。等它长多了传一传代，留点本钱，第一次养出来。呵呵。。。谢了，以后向你请教哦
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