全骨髓培养MSC的注意事项

ytumuyangren

我现在培养的是人的骨髓MSC,全骨髓培养法，现在已经种到培养瓶中，只是在显微镜下看到的是一片红，文献中提到在细胞种到培养瓶两天后晃晃瓶子，让未贴壁的MSC进一步贴壁，还有文献介绍，可以将培养3天后的培养液换到另外一个培养瓶中，给原本的培养瓶加入新的培养液，这样保证未贴壁的培养液继续贴壁，我的问题是，这样培养细胞后，MSC是否能够长满培养瓶，希望各位高手能够给予指点，谢谢了！

snany

要注意 一点，更换的新培养其最好先预热到37度

taxuewuge

我养的不摇瓶子，贴壁的都比较少，摇的话就跟少了，可能与我的取材有关。你去的是哪个部位的骨髓？是红骨髓还是黄骨髓啊？8 ]& y6 q5 [5 E  c/ g& H

Learner

如果是人骨髓与donor的年龄有很大关系，donor年纪越轻贴壁的集落越多，超过四十岁要想长满瓶就比较困难。我认为3天时间贴壁时间足够了，中间不要晃动，镜下也看不见就不要动培养瓶l了。第一次换液不用把血细胞彻底洗净，尽量轻柔，吸取培养基后在侧壁加入培养基。加入bFGF对细胞的早期扩增和增殖非常必要，我用4ng/ml浓度。还有一点是纯属个人经验，就是贴壁的干细胞集落可能是比较轻，如果骨髓和培养基总体积超过30ml,MSC 集落一般比较轻喜欢贴附在培养瓶的斜面部位快到瓶口的部位，镜下可重点观察一下这个位置。或是培养时将培养瓶口稍微垫起来一点这样细胞就不会贴到培养瓶的斜面部分了。

Learner

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取骨髓一般都在髂前上脊的部位取都是红骨髓。

gact

意思，是页面越低越好？
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gact

液面

lidaifu001

细胞培养过程中尽量避免晃动瓶子，尤其是刚开始今天，那个时候贴壁贴的还不够紧，一晃就下来了，更不利于细胞尽快贴壁了。

骨道边

同意楼上的说法，第一次换液之前尽量不要去动它，培养箱能不开的话尽量少开，给它一个比较稳定的生长环境，第一次换液你也可以试一试半量换液，给细胞一个缓冲的过程。本人拙见

pink1198

我的方法是抽取骨髓，全骨髓培养法。取2月龄兔，体重1.5kg左右，麻醉后剪去双侧髂嵴及胫骨术区皮毛，放入含500ml75%酒精桶中皮肤消毒。碘酊再次消毒皮肤，用含500U/ml肝素生理盐水1ml肝素盐水的5ml注射器及针头抽取髂棘部及胫骨骨髓4-5ml,移入4个含8-10mlDMEM的15ml离心管内，放入冰盒转移至培养房。吹打均匀后离心，1200rpm5分钟，PBS再洗一遍，离心。弃掉上清。加入适量培养基含10%FBS及双抗，移入T-25培养瓶,培养基量为4.5ml左右。镜下观察培养瓶内一片红，看不到细胞。不用管它，也不摇晃，就是不用碰培养瓶。48小时第一次半量换液。隔天全量换，这时候镜下观察可以发现变为梭型的MSC，零星的几个小细胞克隆团。以后3天换。镜下培养瓶见不均匀分布的细胞克隆群，有的大片地方没有细胞。待到11-14天有的细胞高度密集，这时1:1传代，含EDTA的胰酶消化大概2分钟，见细胞变皱缩变圆脱壁，培养基终止消化，离心。加入培养基接种培养瓶内继续培养，大概6-7天均匀铺满，进行P2代1:2或1:3传代。1:2传的话3-4天友可以铺满。1：3传的话大概6-7天。