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我的方法是抽取骨髓,全骨髓培养法。取2月龄兔,体重1.5kg左右,麻醉后剪去双侧髂嵴及胫骨术区皮毛,放入含500ml75%酒精桶中皮肤消毒。碘酊再次消毒皮肤,用含500U/ml肝素生理盐水1ml肝素盐水的5ml注射器及针头抽取髂棘部及胫骨骨髓4-5ml,移入4个含8-10mlDMEM的15ml离心管内,放入冰盒转移至培养房。吹打均匀后离心,1200rpm5分钟,PBS再洗一遍,离心。弃掉上清。加入适量培养基含10%FBS及双抗,移入T-25培养瓶,培养基量为4.5ml左右。镜下观察培养瓶内一片红,看不到细胞。不用管它,也不摇晃,就是不用碰培养瓶。48小时第一次半量换液。隔天全量换,这时候镜下观察可以发现变为梭型的MSC,零星的几个小细胞克隆团。以后3天换。镜下培养瓶见不均匀分布的细胞克隆群,有的大片地方没有细胞。待到11-14天有的细胞高度密集,这时1:1传代,含EDTA的胰酶消化大概2分钟,见细胞变皱缩变圆脱壁,培养基终止消化,离心。加入培养基接种培养瓶内继续培养,大概6-7天均匀铺满,进行P2代1:2或1:3传代。1:2传的话3-4天友可以铺满。1:3传的话大概6-7天。 |
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