大家来讨论下，关于人骨髓MSC细胞的来源、培养与软骨诱导

jiojoo

0 v* f6 Q; H; ~7 q  z# b
0 B4 y$ d0 d, S: [$ z我做的是干细胞的软骨诱导分化
& A0 W( q0 g; v& a4 h$ D0 J我做了很长时间的人骨髓间充质干细胞0 L' L0 P0 I3 o  K3 Y
一开始是培养至8或9代使用，做了很久都没诱导成功
/ o9 x" O7 ?' ?2 J, g后来发现别人都用5代以内的，我也试了下，果然效果不错
, h7 F& V! L: r1 v/ }但是，软骨诱导本来就需要很大量的细胞；如果对细胞代数还要求这么高，很难满足其所需的细胞量啊，MSC扩增速率很一般，而且只能传到4到5代，这个细胞来源就是很重要的问题了2 `. i6 B2 E. ?& J) p
有做过相同研究的么？怎么解决细胞来源的问题？  l9 D, j2 k1 R0 Y2 A
下面传一些图片
) u) d1 ]) \( c7 S5 j2代的细胞，状态都很好
" K7 T& U! p6 u4 F# c5 l; Z! y% ?, J  w

$ }- e8 h8 d! C# I& e: i另外，最近我养的一些hMSC，还没传到5代，状态就很差了，感觉折光性不够，很杂乱一样
# l, @- g" ?( N7 [! ~/ _对于细胞状态，应该怎样描述？我就知道状态好的看起来黑一点，而且形态饱满，差的话就感觉没那么黑，细胞没什么立体感  |3 T4 Y9 V3 t5 I/ c# p/ t8 {
有没有同样培养骨髓干细胞的？培养这种细胞要注意哪些方面才能养好呢？( R, f) y" H6 X
+ ~6 J: V& o/ b! J, m+ W/ J" q9 _
( X( G$ U, p7 X& q% |: ~' Z- j/ c
我的培养条件：. t; S8 M7 H5 z) G  u
培养基LDMEM是gbico干粉自己配，FBS也是gbico的，1500，500ml那种
$ T! p" \# v  l2 D& w% g双抗都不加的

viv2005

我养的大鼠的，感觉也是到第5代左右，细胞就没有那么有立体感了，感觉大了，趴在壁上了

ytumuyangren

你的这个细胞的状态很好，我也养的是hMSC,但是我用的是HDMEM，血清用的是hyclone的，只不过开始取材的时候量太少，细胞不是很好，后来养出来的细胞就挺好的，文献中交代是一般都用5代的，再往后的话细胞的状态不是很好，不适宜诱导了。

daviddow

你自己更换一下培养基，其实MSC生长很快的，不是一般的快

gact

回复 jiojoo 的帖子
( F& ~. q$ E; c: {
  [! y4 }; d& U我养猪的，长太慢太慢。大概到现在将近20d，只刚传了2代。。。。
& Z0 {  H# t* b- g我用F12 +20%血清。。。。。
$ Q0 P5 z5 l, f. f: J( x状态没你的那么密集。。。。

jiojoo

回复 daviddow 的帖子! F4 f! `1 c& g
7 _  Z8 ^" v" \, j. H7 f
换哪种培养基呢？
' S3 M& m% g1 A( K3 v可否指教一下
- R3 e3 l/ W; _* F4 U因为我这里培养的细胞生长速度真的很一般，很容易就状态变差了，长四五天都可能长不起来

daviddow

回复 jiojoo 的帖子
$ T  s' ]: Q9 M+ d- K0 M, N* [: c. i9 z% f
你查查资料吧，搜索一下文献，就有。就是价格很贵

骨道边

回复 viv2005 的帖子
& M$ l/ C! y6 u, Y; b  J% E$ P' Z8 S5 c5 L( b% I* T; h% r+ R: N
你好，我养的大鼠的干细胞，可是一直以来养都不成功，就是有时候出来一点的话就是长的很慢而且是死活多长时间都没完全铺满瓶底。再出不来我老板就准备放弃我了。你能帮帮我吗？
1 _7 C9 F; b) F我的具体步骤如下! c7 W. n$ S/ T. |+ q5 s& y1 \' ]; S. l
1 提取骨髓间充质干细胞
7 O; h0 j1 I- G/ x$ P        150-180g的SD大鼠处死，解剖取下后肢，不要破坏股骨头关节面，从踝关节到股骨头部分，只把皮剥掉，还保留肌肉等软组织5 \9 a' w' G1 ~2 h0 t6 c" u) V
        泡到75%酒精10分钟
  ]3 D% ?! {3 b" f4 i6 |0 j        移入超净台，用PBS漂洗两遍（培养皿中完成）
: ~" v% J5 ~7 q; n% e        移入一个新的培养皿中换用另一套解剖器械剃掉软组织，越干净越好1 ~0 G3 ~( @& H
        从膝关节处分为两段' e4 V& d( a* ^
        移入装有10ml左右的PBS的培养皿中# Q1 u; C$ ^1 z, a
        咬骨钳要掉长骨两端
& i+ Y3 V' M. c0 a" v        5ml的一次性注射器吸取培养液冲洗骨髓，一般吹洗3-5遍
: G0 G1 v- R" ?9 g2 ?! W        吸管吹匀冲下来的骨髓（不可用力过猛）, k. m6 V, D% T
        收集到15ml离心管中1000r/minx10min离心弃上清
" `( x% D8 `" ^; v        8ml新鲜的培养液（15%新生牛血清的α-MEM）重悬细胞
+ P( R- M" I# \: \        移入培养瓶培养
4 M# y. ^, ]! K- l# V( C        48h半液量换液. w; E. v. h4 r, X6 J
        再24h后全量换液; Z& I5 z7 U+ h
        之后两三天换一次
. w7 `5 b  c! o: _7 K1 s        附：血清用的是gbico的，培养液是hyclone 的
# z9 _& D* D* R: @+ U% H

骨道边

回复 jiojoo 的帖子
; L. d: j7 k4 V# Z3 A5 l$ K
5 f( r' |$ }4 [' _) ^0 E) c我也做干细胞向软骨诱导的，现在一直处于起始阶段，细胞一直养不出来，不知道能不能把你的步骤和参数给我一份啊，救救小弟啊。不然我老板就对我彻底的失望了，那样的话结果就是准备放弃我了。谢谢了

viv2005

回复 骨道边 的帖子
+ U4 i* b" X) c8 `( A$ y# _/ F9 z1 ?3 x7 K
跟你的操作基本是相同的，就是血清我们用的是ES血清，是干细胞专用的，你的新生牛血清可能营养不够吧，我猜。还有细胞密度可能也受影响，我有一次，细胞弄的密度大了，反而贴壁的不好。我现在一般一条腿弄出来的放一个100mm的dish