求救，关于ES的转染问题

always_wp

我要做的大概是向ES转染一个目的基因，请问有谁做过呢？能不能给些建议。

bllx58

做过用病毒转染的，早代的ES R1，没转进去

zpzp0312

用eppendorf的电转融合仪
0 E) ?5 N( T6 R. q2 A9 H3 s. a它里面有配送的cuvvete

zpzp0312

bio-rad应该也可以

always_wp

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& N9 t+ b$ U9 @! D% H" o6 A% X! l/ z' |9 y/ k
你好，请问你是不是用bio-rad的做过电转啊，能不能给点实验参数和经验啊，谢谢啦

always_wp

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' A8 P+ H3 Q3 l+ N; r  d' X5 b0 U% d% w
你好，我们实验室只有bio-rad的电转仪，请问能不能告诉我你做电转时候的一些参数啊 谢谢啊
; z* q& _7 V1 ^0 s0 j

zpzp0312

这里有些参数
$ ]; i+ e3 P# k# P# e/ O8 H: u可以参考一下/ m1 e& |- c! f; }2 d
我们也在摸索中3 W- u' ], r7 |; S* f+ `1 F7 t- W
200V ，500uF；800V，3uF；220V，950uF，1000Ω；600V，25uF，200Ω；240V，500uF；330V，250uF
  X, T9 E$ h3 D+ h9 B
7 v7 v2 ~% g: G另外，G418抗性的MEFs你们从哪里得到的，我们也需要，只是不知在哪里能够找到状态和质量较好的

llecstem

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- X* M9 u1 z, Y( ?# Z2 _$ Q0 q! I! z0 S( P' ^- B7 H2 R6 U
你好！我也在摸索电转的条件，因为以前没做过电转，想向你请教几个问题，一是我看电转的条件一般都是电压和电流两个参数，还有其他什么比较关键的参数吗？220V，950uF，1000Ω；你后面提供的是电阻吧，它对转染的效率有影响吗？还有，不同种属来源的mES细胞最佳电转条件差异大吗？希望你方便的话帮我解答一下，谢谢！
1 ]5 N7 f. A$ O" G  ]2 }" ?另外我们实验室从NEO小鼠获得的MEF，筛选的时候死的很厉害，也正为neo-MEF发愁，怀疑小鼠出问题了

zpzp0312

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; K6 o0 t% C( U4 Y" x) l+ v- P3 X! H$ E. z# B; C
一般应该是电压和电容两个参数吧？！1 O3 s8 }7 l) Y' r& Q  g- h  l
似乎这些参数之间都是有联系的，一般电容越低电压就越高$ [9 b% v7 v# K4 X
另外，电阻有的机器需要设定，有的就不用，一般电阻越大放电时间越短。( `' d0 }+ u  m: h( p) @- L
电阻也就只是其中的一个参数罢了，转染效率还是这些参数综合的结果
4 B0 D* O) a9 d7 ?  I- @具体还需摸索啊1 R' x7 d: I0 X- U. p8 j
另外我觉得不同来源的ES电转差异应该不会很大，毕竟是一类细胞，组织构成应该很相似吧！
) l. S% f1 O5 B( n1 D) [G418浓度多大啊？会不会是加多了？一般说来G418浓度在200-300之间2 Z7 I( |, E  |/ f( a  ?  x
应该做个梯度去检测一下MEF的最大耐药剂量

llecstem

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/ Q& |3 N; O% f* s+ }7 a& T) c/ F8 t! _9 S" Y. \2 Z2 y9 z# j
谢谢！以前实验室用neo-mouse的小鼠做过一批MEF，用同样浓度的G418筛没有问题，就是最近做的这一批有问题，怀疑老鼠出问题了，正在检测。