求救，关于ES的转染问题

always_wp

我要做的大概是向ES转染一个目的基因，请问有谁做过呢？能不能给些建议。

bllx58

做过用病毒转染的，早代的ES R1，没转进去

zpzp0312

用eppendorf的电转融合仪
1 J& ?% [+ Z; U, a它里面有配送的cuvvete

zpzp0312

bio-rad应该也可以

always_wp

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& w. M7 Z1 L6 h: S7 l
& ?7 n2 m( W' u: g  o2 @你好，请问你是不是用bio-rad的做过电转啊，能不能给点实验参数和经验啊，谢谢啦

always_wp

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4 z# [& f( ^- O- `5 I; w8 k0 E1 _# e
: G+ L, ?8 J$ D$ J8 z3 n+ c你好，我们实验室只有bio-rad的电转仪，请问能不能告诉我你做电转时候的一些参数啊 谢谢啊
2 p& |7 b  o+ I- o

zpzp0312

这里有些参数, E' d- \* T, u2 f
可以参考一下
8 }: P+ D$ W; b% z# i我们也在摸索中
% H, \5 G* k, p' F200V ，500uF；800V，3uF；220V，950uF，1000Ω；600V，25uF，200Ω；240V，500uF；330V，250uF
# [( \& ^9 o7 f% J9 `& _+ m& x2 z& J+ b/ m% w# B% H0 A: r8 i
另外，G418抗性的MEFs你们从哪里得到的，我们也需要，只是不知在哪里能够找到状态和质量较好的

llecstem

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3 M- ^& b  f9 R7 O
# V0 Z9 D3 o! f9 S3 H& b! E你好！我也在摸索电转的条件，因为以前没做过电转，想向你请教几个问题，一是我看电转的条件一般都是电压和电流两个参数，还有其他什么比较关键的参数吗？220V，950uF，1000Ω；你后面提供的是电阻吧，它对转染的效率有影响吗？还有，不同种属来源的mES细胞最佳电转条件差异大吗？希望你方便的话帮我解答一下，谢谢！
9 r/ k8 k9 V2 {$ o* [6 A另外我们实验室从NEO小鼠获得的MEF，筛选的时候死的很厉害，也正为neo-MEF发愁，怀疑小鼠出问题了

zpzp0312

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/ h0 |* D" a- P$ g( J% v3 v- T; Z0 }; }% I* m
一般应该是电压和电容两个参数吧？！" B" @) F' u( u' m# w. _
似乎这些参数之间都是有联系的，一般电容越低电压就越高2 K9 k6 _- o$ \
另外，电阻有的机器需要设定，有的就不用，一般电阻越大放电时间越短。" b, c& J; L; t* }4 d5 }6 d- a) q/ N
电阻也就只是其中的一个参数罢了，转染效率还是这些参数综合的结果
: r0 w& L/ a4 J& S* Z" G具体还需摸索啊" U! W" p* ~  Y( E" P
另外我觉得不同来源的ES电转差异应该不会很大，毕竟是一类细胞，组织构成应该很相似吧！
! y% N8 _- @$ I2 P% K3 PG418浓度多大啊？会不会是加多了？一般说来G418浓度在200-300之间5 e2 v. D$ x' h3 Q  l# [; N
应该做个梯度去检测一下MEF的最大耐药剂量

llecstem

回复 zpzp0312 的帖子' d. h9 j5 R1 W7 p

2 U% F- k. ^9 F# T9 g谢谢！以前实验室用neo-mouse的小鼠做过一批MEF，用同样浓度的G418筛没有问题，就是最近做的这一批有问题，怀疑老鼠出问题了，正在检测。