MEF 原代分离的问题

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MEF分离时 有什么好的方法尽可能的剪碎胚胎吗？我用剪刀剪累了，感觉也不理想，最终有很多组织小块。5 E! Y8 s- F, Z7 e3 Z
剪碎后，消化后是一团絮状，不容易吹散是怎么回事？我怀疑是消化过了。

osterix

不是消化过了，你试试分步消化呢，少量多次；

pheebs

我的做法是将去头尾四肢内脏后的胚胎放入0.25% trypsin-EDTA（3ml/胚胎）中4°C过夜，第二天早晨吸去2/3胰酶，37C水浴20min，加 25 ml DMEM+10%FBS(for a 50-ml tube) 或者 8 ml (for a 15-ml tube)反复吹打，静止1 min左右转移出上清，剩下1-2ml含未分散的组织块，继续吹打，最后合并上清。铺板。效果很好。做得好的话一个E14.5的胚胎可以铺5个10cm dish。

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: ?8 I( P6 [5 ^6 v$ D3 U, Y; [5 B0 s
  O0 ]+ u2 ^* x' x8 S9 r1 t几个10cm dish 相当于1个T75啊3 q4 _' _( }+ i+ b6 D) I
为啥要过夜这一步？

fan17930

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. M) {: s1 n- B+ Z你这种过夜消化，是你就这么做到吗？  那之后细胞状态如何？ 有没有拉长老化？ 可以上图吗谢谢

pheebs

回复 573639471 的帖子, y5 d" q6 [' F8 G% C
* q" i5 F& c) j# q! Z
10cm dish和T75面积差不多的。# e, O0 ^( h! F3 j5 \# Z" z$ t  d: S0 E
低温消化，就要过夜啊。

zerollx

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* z7 {8 ]& i# R5 j
) z3 J! V6 _; U7 K. F. U* f      12.5天的胚胎是很嫩的，随便剪几次就剪碎了  ，不知道你用的是多少日龄的胎鼠。
" `5 C; R/ L# q; R    消化后出现絮状物很正常，这时候你要做的是将其成分吹散，但是即使吹散，细胞间还是有胞间连接的，此时直接离心得到的不是细胞沉淀，而是胶状物，直接培养细胞的死亡率是很高，而且细胞的状态也不会好。
* B7 D) x  ~6 v     所以我们的做法是：消化10min后，终止消化，再用200目纱布过滤，若离心后的细胞还是胶状物，说明过滤得不够充分，可以考虑再次过滤！

573639471

回复 zerollx 的帖子, v& ]+ v+ S% o% r( f9 P
6 ~" J5 `0 V6 {9 d& n8 t7 ^3 Y
我用的13.5天的  容易剪成小块，但是再想更小一点就很难了 过滤是过滤掉组织块吗？还是通过过滤能打散胞间链接啊

zerollx

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% l/ [5 h6 p) P! w# h5 D, H过滤的是过滤掉胞间连接，过滤完之后你会明显的发现滤膜上有很多的胶状物，而且此胶状物即使用胰酶继续消化液消化不出多少细胞，胞间连接过滤掉之后，此时的细胞才是真正的单个细胞，能明显的提高细胞的存活率及其活性，对其后期的状态影响是非常大的，是我个人实验过程中的一点心得，仅供参考……

573639471

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& K5 R5 T7 C3 [
非常感谢，下次试试