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脂肪间充质干细胞克隆形成能力求助 [复制链接]

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楼主
发表于 2011-6-23 10:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
小弟在做脂肪间充质干细胞克隆形成能力时成功率很低。
! p' m) ~; {* S+ `* T) U# Z( d( o+ P5 `  Y
ADSCs是两周昆明小鼠自己原代培养的,p1,p2状态都可以,养的好的话到P5,P6还能保持相对较好的细胞形态,但有时P4也会就出现衰老迹象。: Q  e1 k8 P  D$ n

/ l. U4 O1 E& b1 G0 m& g$ b8 _培养基日常用DMEM/F12加10%FBS,bFGF,EGF。* ]. r* O1 V# N. O+ [7 f

: [5 e: L6 m. ?5 B% Q细胞密度从6孔板每孔10——500个细胞都做过,用过P2细胞也用过P5的,感觉少于100个细胞就基本没有细胞贴壁,之前也有实验是贴壁了但基本不分裂就直接铺展开了。细胞多了倒是能看到克隆,但是那么细胞基数大克隆形成率就惨不忍睹了。(我看有些文献做克隆形成能力也是用几千个细胞,但是导师说初始细胞数要少才行,60mm培养皿最多就种100个细胞)
6 v$ I5 y7 H: ~$ p) @. u, z
% B  D$ U# c- p0 T9 x现在在最初接到6孔板时,加一些低代ADSCs80%融合时取的过滤的条件培养液,但似乎也没什么效果。
! ?0 u5 b4 b; B" B, E0 I) U( w1 s2 P* f$ `' [. m
所以想请教各位同学老师,你们在做克隆形成能力时有没什么秘籍,用的几代的细胞,用多大的皿或孔板,接种密度多少,影响最重要的因素是什么,培养基量,小分子浓度,是不是要用琼脂或多聚赖氨酸包一下培养皿呢?  z: b! H1 K+ r* M0 h/ ?

; w7 m& o" s( c6 b# [+ r或者是不是我的稀释方法有问题,我的细胞稀释方法是,消化计数,然后取100微升稀释到1毫升,细胞密度降了10倍,然后反复几次到每毫升百个细胞的量级。
# c% X1 A3 v+ f# H% K
% Q2 ]. ^4 K$ `望版主大大和老师同学不吝赐教,多多交流。
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沙发
发表于 2011-6-23 22:00 |只看该作者
我也有相似的问题,觉得细胞增殖能力还不错,但是做的P3呆的克隆,细胞就是不能形成克隆。。。最多的就是十来个,是不是一般克隆形成平均也得50个左右啊?我也是,在60mm的皿接种了100个细胞做的。。。
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藤椅
发表于 2011-6-23 23:14 |只看该作者
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8 V5 v/ d& I5 G  q! }8 Z6 M& y0 \1 g0 P* K# ]& |% @& C3 c4 e/ j6 R
好冷清啊,10个的话如果细胞形状没有明显变衰老的感觉再养养吧。应该是50个以上才算,不过30多个应该也差不多了,MSC个子那么大
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