脂肪间充质干细胞克隆形成能力求助

beginner

小弟在做脂肪间充质干细胞克隆形成能力时成功率很低。
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ADSCs是两周昆明小鼠自己原代培养的，p1,p2状态都可以，养的好的话到P5,P6还能保持相对较好的细胞形态，但有时P4也会就出现衰老迹象。: Q  e1 k8 P  D$ n

/ l. U4 O1 E& b1 G0 m& g$ b8 _培养基日常用DMEM/F12加10%FBS，bFGF,EGF。* ]. r* O1 V# N. O+ [7 f

: [5 e: L6 m. ?5 B% Q细胞密度从6孔板每孔10——500个细胞都做过，用过P2细胞也用过P5的，感觉少于100个细胞就基本没有细胞贴壁，之前也有实验是贴壁了但基本不分裂就直接铺展开了。细胞多了倒是能看到克隆，但是那么细胞基数大克隆形成率就惨不忍睹了。（我看有些文献做克隆形成能力也是用几千个细胞，但是导师说初始细胞数要少才行，60mm培养皿最多就种100个细胞）
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% B  D$ U# c- p0 T9 x现在在最初接到6孔板时，加一些低代ADSCs80%融合时取的过滤的条件培养液，但似乎也没什么效果。
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所以想请教各位同学老师，你们在做克隆形成能力时有没什么秘籍，用的几代的细胞，用多大的皿或孔板，接种密度多少，影响最重要的因素是什么，培养基量，小分子浓度，是不是要用琼脂或多聚赖氨酸包一下培养皿呢？  z: b! H1 K+ r* M0 h/ ?

; w7 m& o" s( c6 b# [+ r或者是不是我的稀释方法有问题，我的细胞稀释方法是，消化计数，然后取100微升稀释到1毫升，细胞密度降了10倍，然后反复几次到每毫升百个细胞的量级。
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% Q2 ]. ^4 K$ `望版主大大和老师同学不吝赐教，多多交流。

sunsun

我也有相似的问题，觉得细胞增殖能力还不错，但是做的P3呆的克隆，细胞就是不能形成克隆。。。最多的就是十来个，是不是一般克隆形成平均也得50个左右啊？我也是，在60mm的皿接种了100个细胞做的。。。

beginner

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好冷清啊，10个的话如果细胞形状没有明显变衰老的感觉再养养吧。应该是50个以上才算，不过30多个应该也差不多了，MSC个子那么大