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脂肪间充质干细胞克隆形成能力求助 [复制链接]

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楼主
发表于 2011-6-23 10:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
小弟在做脂肪间充质干细胞克隆形成能力时成功率很低。0 Q$ u: S& T/ {4 p) [8 M3 V% i
1 ^( D) _6 z+ y- }. i
ADSCs是两周昆明小鼠自己原代培养的,p1,p2状态都可以,养的好的话到P5,P6还能保持相对较好的细胞形态,但有时P4也会就出现衰老迹象。/ h$ y1 f+ h3 r& \3 m/ w

5 V" S  R8 H" P培养基日常用DMEM/F12加10%FBS,bFGF,EGF。
5 G" ?0 L+ }( [9 W
1 v: n# ]% E- L/ c- h细胞密度从6孔板每孔10——500个细胞都做过,用过P2细胞也用过P5的,感觉少于100个细胞就基本没有细胞贴壁,之前也有实验是贴壁了但基本不分裂就直接铺展开了。细胞多了倒是能看到克隆,但是那么细胞基数大克隆形成率就惨不忍睹了。(我看有些文献做克隆形成能力也是用几千个细胞,但是导师说初始细胞数要少才行,60mm培养皿最多就种100个细胞)
. K4 Q0 a) n/ l' J" r- |. |9 J) W/ O) b
现在在最初接到6孔板时,加一些低代ADSCs80%融合时取的过滤的条件培养液,但似乎也没什么效果。8 A) B/ u) B* a
7 L5 A9 j2 X5 j3 g8 _
所以想请教各位同学老师,你们在做克隆形成能力时有没什么秘籍,用的几代的细胞,用多大的皿或孔板,接种密度多少,影响最重要的因素是什么,培养基量,小分子浓度,是不是要用琼脂或多聚赖氨酸包一下培养皿呢?
- c$ d# H' Q% d  f) e3 [
- s' f1 X; @2 w/ q/ i- A或者是不是我的稀释方法有问题,我的细胞稀释方法是,消化计数,然后取100微升稀释到1毫升,细胞密度降了10倍,然后反复几次到每毫升百个细胞的量级。4 K' C- l2 ~1 o% F

0 v6 V( A5 R5 k% i" T3 b# l3 x望版主大大和老师同学不吝赐教,多多交流。
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沙发
发表于 2011-6-23 22:00 |只看该作者
我也有相似的问题,觉得细胞增殖能力还不错,但是做的P3呆的克隆,细胞就是不能形成克隆。。。最多的就是十来个,是不是一般克隆形成平均也得50个左右啊?我也是,在60mm的皿接种了100个细胞做的。。。
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藤椅
发表于 2011-6-23 23:14 |只看该作者
回复 sunsun 的帖子! X4 X+ o. ~; x' {

6 H- N- t( M( E9 ~$ r好冷清啊,10个的话如果细胞形状没有明显变衰老的感觉再养养吧。应该是50个以上才算,不过30多个应该也差不多了,MSC个子那么大
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