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脂肪间充质干细胞克隆形成能力求助 [复制链接]

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楼主
发表于 2011-6-23 10:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
小弟在做脂肪间充质干细胞克隆形成能力时成功率很低。
/ x& S$ {' R1 [6 G' Y
( c/ v) @0 |  u& P6 R7 XADSCs是两周昆明小鼠自己原代培养的,p1,p2状态都可以,养的好的话到P5,P6还能保持相对较好的细胞形态,但有时P4也会就出现衰老迹象。" f* i* [% u6 ~( N5 B$ e8 Z. F
; T% P6 S2 _& @- r7 \' K
培养基日常用DMEM/F12加10%FBS,bFGF,EGF。5 n- a; j" A: L& [$ `9 H

$ T8 e, R( Q: I( r细胞密度从6孔板每孔10——500个细胞都做过,用过P2细胞也用过P5的,感觉少于100个细胞就基本没有细胞贴壁,之前也有实验是贴壁了但基本不分裂就直接铺展开了。细胞多了倒是能看到克隆,但是那么细胞基数大克隆形成率就惨不忍睹了。(我看有些文献做克隆形成能力也是用几千个细胞,但是导师说初始细胞数要少才行,60mm培养皿最多就种100个细胞)1 Z  Y' E' {8 q" U8 H; E$ p
6 f! s6 c/ }# y
现在在最初接到6孔板时,加一些低代ADSCs80%融合时取的过滤的条件培养液,但似乎也没什么效果。
6 y! T! x8 U" Q# e1 Q3 S
0 l4 h6 [+ u1 _; v( W4 Z6 E( ?所以想请教各位同学老师,你们在做克隆形成能力时有没什么秘籍,用的几代的细胞,用多大的皿或孔板,接种密度多少,影响最重要的因素是什么,培养基量,小分子浓度,是不是要用琼脂或多聚赖氨酸包一下培养皿呢?
8 ?" k9 W, r) K- V3 m5 K: W9 p
: G, O5 k) W( T7 c5 _7 r或者是不是我的稀释方法有问题,我的细胞稀释方法是,消化计数,然后取100微升稀释到1毫升,细胞密度降了10倍,然后反复几次到每毫升百个细胞的量级。
+ |! O  \9 g% ^4 D/ c' v$ x4 M
( I# A! o* _2 T$ |8 `; D1 v望版主大大和老师同学不吝赐教,多多交流。
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沙发
发表于 2011-6-23 22:00 |只看该作者
我也有相似的问题,觉得细胞增殖能力还不错,但是做的P3呆的克隆,细胞就是不能形成克隆。。。最多的就是十来个,是不是一般克隆形成平均也得50个左右啊?我也是,在60mm的皿接种了100个细胞做的。。。
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藤椅
发表于 2011-6-23 23:14 |只看该作者
回复 sunsun 的帖子4 s+ o7 ~- P7 w8 D; R2 D; O
- \% S2 B: j% ?  I  v
好冷清啊,10个的话如果细胞形状没有明显变衰老的感觉再养养吧。应该是50个以上才算,不过30多个应该也差不多了,MSC个子那么大
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