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小弟在做脂肪间充质干细胞克隆形成能力时成功率很低。# d, L' A' o0 O4 K/ X! Y1 v
8 ^2 G/ j1 k# {/ XADSCs是两周昆明小鼠自己原代培养的,p1,p2状态都可以,养的好的话到P5,P6还能保持相对较好的细胞形态,但有时P4也会就出现衰老迹象。: U8 f2 W* j9 Z7 o' E
, x' z4 m0 b; f- \* h9 ?" L培养基日常用DMEM/F12加10%FBS,bFGF,EGF。6 g7 W+ R* j1 n/ ~ n3 v
8 d1 f& _( T) V# o细胞密度从6孔板每孔10——500个细胞都做过,用过P2细胞也用过P5的,感觉少于100个细胞就基本没有细胞贴壁,之前也有实验是贴壁了但基本不分裂就直接铺展开了。细胞多了倒是能看到克隆,但是那么细胞基数大克隆形成率就惨不忍睹了。(我看有些文献做克隆形成能力也是用几千个细胞,但是导师说初始细胞数要少才行,60mm培养皿最多就种100个细胞)
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1 U* i* [ O) j1 U) d X现在在最初接到6孔板时,加一些低代ADSCs80%融合时取的过滤的条件培养液,但似乎也没什么效果。% J& n/ C( f' p$ K2 }# r
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所以想请教各位同学老师,你们在做克隆形成能力时有没什么秘籍,用的几代的细胞,用多大的皿或孔板,接种密度多少,影响最重要的因素是什么,培养基量,小分子浓度,是不是要用琼脂或多聚赖氨酸包一下培养皿呢?" H8 p" R! j2 B
# Q7 e3 T" A0 L7 m, R9 E3 w! i或者是不是我的稀释方法有问题,我的细胞稀释方法是,消化计数,然后取100微升稀释到1毫升,细胞密度降了10倍,然后反复几次到每毫升百个细胞的量级。9 A7 n1 b; l/ O' O. l
# C; _. ]% c- s3 \ d, }( I5 ^: C- ^望版主大大和老师同学不吝赐教,多多交流。 |
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