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小弟在做脂肪间充质干细胞克隆形成能力时成功率很低。
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ADSCs是两周昆明小鼠自己原代培养的,p1,p2状态都可以,养的好的话到P5,P6还能保持相对较好的细胞形态,但有时P4也会就出现衰老迹象。1 i) Z* Z* U5 O2 M+ B
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培养基日常用DMEM/F12加10%FBS,bFGF,EGF。# Z8 _" N# _3 t7 o" Y, b
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细胞密度从6孔板每孔10——500个细胞都做过,用过P2细胞也用过P5的,感觉少于100个细胞就基本没有细胞贴壁,之前也有实验是贴壁了但基本不分裂就直接铺展开了。细胞多了倒是能看到克隆,但是那么细胞基数大克隆形成率就惨不忍睹了。(我看有些文献做克隆形成能力也是用几千个细胞,但是导师说初始细胞数要少才行,60mm培养皿最多就种100个细胞)
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& |, z) p# Q& \' z. V" h8 a' m. D现在在最初接到6孔板时,加一些低代ADSCs80%融合时取的过滤的条件培养液,但似乎也没什么效果。 J: T& a+ j `+ Y
9 m+ R$ \9 }1 f/ k5 I c所以想请教各位同学老师,你们在做克隆形成能力时有没什么秘籍,用的几代的细胞,用多大的皿或孔板,接种密度多少,影响最重要的因素是什么,培养基量,小分子浓度,是不是要用琼脂或多聚赖氨酸包一下培养皿呢?
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或者是不是我的稀释方法有问题,我的细胞稀释方法是,消化计数,然后取100微升稀释到1毫升,细胞密度降了10倍,然后反复几次到每毫升百个细胞的量级。
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望版主大大和老师同学不吝赐教,多多交流。 |
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