提总RNA问题

pla269

在提总RNA的是时候，因为细胞不同加入trizol的量不知道如何估计，大侠们指点一下

huangcong1988

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$ o$ x3 ?3 I) C
: V% c& S3 I) m' j6 I! m* |) T恩，我指的就是磨完样的大小，绿豆粒大就够，提完以后绿豆大？他是要提多少？？？trizol是要钱的！

endless-caas

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3 \8 y: |/ \% Y9 j- ?- o
$ x+ \- G7 J  v" Y+ ?+ p咦，我弱弱问一下，你们说的绿豆料大小是指的提前的组织的样品大小还是提完后的RNA的大小？我理解huangcong所言应该是指磨完后的样的大小吧？而pla的意思是不是指的提完后的RNA的大小？两者说的似乎不是一回事吧？

sdjjfangfang

我们都是将贴壁细胞消化下来，离心，PBS洗涤后添加到TRIZOL，一般T25的小瓶消化下来的细胞就加1ml，效果还可以，提的浓度都还挺高的，纯度也还可以

huangcong1988

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1 x3 c7 P- D: d% r8 K! {: r! R$ Q8 @% L/ _( `- G
貌似这个没什么窍门，就是磨样呗，多了就少取点，一般样品是足够的，而且比较多，所以磨样的时候如果样品溅出来，没事的，放弃那一点，要不了那么多，主要是样品分开时候比较难，分开之后可以选择性的放弃磨一部分

pla269

回复 huangcong1988 的帖子) Y- k! K9 P: Z

; R6 o9 }. b7 Z提成绿豆粒大，已经不小了，你有什么窍门吗
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endless-caas

回复 huangcong1988 的帖子# _& U. a, O& G3 k0 u

* v* h3 P. a/ g& aOK，你的经验给我提供了一定的参考价值。其实我们提的也是动物组织，大小也就像你说的豆粒般大，不过，你们用研钵磨这么小的样，我觉得很厉害。我们时常是直接在1.5的离心管里面磨，但是就是不好做到一边磨一边加液氮，一般也就加一点就磨了，磨完就放冰上。可能还是提得少，所以，我提的结果有时候就是不太好，呵呵，学习了噢！

chliu

我们用invitrogen的，只要少于说明书上的样品的量，一般用1ml。

huangcong1988

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7 I2 c( a! h9 l3 q; U- p8 s# W& z* i1 Q8 K! S6 o
你们磨的是植物组织还是动物组织？我们磨的是动物组织，用的是瓷棒，跟研钵一样的瓷的。
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是啊，磨样多少一般都是凭经验，大概可以就行，一般就是绿豆粒那么大就行，其实黄豆粒大也行，主要是加入trizol的量有限，磨太多样不仅浪费体力，trizol对于RNA的抑制作用也不能正常发挥，所以还是尽量不要太多，用肉眼看，一般那个小勺三分之一就够。
8 f8 p) @4 F3 h% e( r, o' C磨样肯定是要在液氮中磨的，取出样的时候也要把样放在液氮中，其实比较标准的磨样，整个过程都是在液氮中进行，所以边磨要不断加氮，不要使研钵中的氮干掉，还有开始要加氮到放有研磨棒的研钵中预冷。
1 j& t5 |/ z1 ~: u这些都是个人经验，你们可以试试! K$ W; _/ u, T+ \( D
样品最好是磨得细一点比较好，那样提RNA的效果也好一点，而且尽量要缩短时间，因为时间一长，RNA肯定会降解，提的效果肯定受影响。
; }: L4 b4 n  I. c磨样过程中样品飞溅，如果说样品比较多，溅出去的就不管了，反正提RNA要不了那么多样，如果捡到研钵中会使样品污染，还有就是由于磨样需要很大力气，所以在所难免会使得氮啊，样品粉末啊，混合液啊溅得到处都是，最好在磨样之前在台面上铺几层一次性PE手套，这样使得台面比较干净，而且铺手套有一定缓冲作用，不至于使台面受损。

endless-caas

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( G: J# ]  z6 i2 Y4 X! m0 P
交流一下下，你们磨样用的是什么样的棒？是用的一次性的塑料的还是用的电动的铁棒的呢？其实对于磨样，我有时提的时候，就是看的经验，觉得差不多了就行了，但是，可能仅从眼观上看肯定是会有误差的，你们一般是以什么标准呢？磨样加液氮好还是不加好？如果加的话，一定要磨成粉吗？对于磨样过程中样品的飞贱你们怎么看待呢？