WB实验问题，谁遇到过？

龙之吻

大家好，我在做WB实验时无论做什么抗体最好都是两条带，即55和34KD左右，即便内参GAPDH也是如此。在下郁闷之极，大家有遇到过这种问题的吗？怎么回事呢，该怎么解决呢？我样品处理是裂解液裂解，加5*buffer（含b-巯基乙醇，无DTT），煮样5分钟变性，-80°C保存备用。好像不像是降解了。额~~~

james_0619

个人认为,换掉样品试试,用其他的组织再做一次,排除样品问题;同时换一种封闭液,如低浓度的明胶,我想总是能排除你的问题的

rain2402

我个人觉得，既然是单抗，那你应该多注意封闭时封闭液的浓度及封闭时间，而且也应该加入DTT。

zxcv12345

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3 U  I9 a/ V. D2 e. z7 c' r% I+ S2 M9 _, b+ n
可检查下你的电泳缓冲液上样缓冲及配胶缓冲液中有无SDS
) F8 a2 j; ~) V6 h* m; z- V4 r: @* R& z* C
你个这问题不是抗体问题，转移问题，
4 J# `! ?! |, Y( L, \* w5 e很可能是跑胶的问题! U2 @: P4 k; V* Z% f
" G2 ?2 K$ D# r
以前一个本科小朋友帮着配跑胶溶液，结果跑胶带型怪异，反复检查后发现是没有加SDS。你可检查有无SDS。

jijuling

曾经比较过，RIPA裂解得到的蛋白电泳的背景比较干净，如果直接用loading buffer裂解，背景会比较杂

guguai

有时候洗膜的强度不够或者是抗体的浓度过高，包括2抗，会出现这个问题。

hxf_86

你这个问题跟我的有点像。
6 l) W2 J( T8 C$ R请问你的抗体是自己做的还是买的商品？有可能是多抗不纯，或者多抗合成的时候特异性不高？

龙之吻

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- v' Z1 L5 U( G3 T- |9 h) z) o& F0 ~+ s& l$ P" o3 M7 |* E6 V- b% N
，好的，我现在正做半干转和湿转呢。坐下对照吧，湿转效果好但就是耗时。呵呵，O(∩_∩)O谢谢

张也行

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- C3 z1 M8 z( c
- W9 o% E$ E8 B, v% D( `不好意思啊，我一直用的都是湿法转膜，所以不太清楚半干法的条件。不过你上网查一下吧，肯定会有很多的。

龙之吻

回复 张也行 的帖子, T7 J. g) c) I) X
) Y# n8 ]; q1 S( ?: g
恩恩，我的好了，好像我的loading buffer不行了。后来重新配置的加了DTT后现在显了GAPDH终于对了。谢谢。想问下你知道伯乐半干转对不同分子量的转膜条件吗？