WB实验问题，谁遇到过？

龙之吻

大家好，我在做WB实验时无论做什么抗体最好都是两条带，即55和34KD左右，即便内参GAPDH也是如此。在下郁闷之极，大家有遇到过这种问题的吗？怎么回事呢，该怎么解决呢？我样品处理是裂解液裂解，加5*buffer（含b-巯基乙醇，无DTT），煮样5分钟变性，-80°C保存备用。好像不像是降解了。额~~~

boxmanfist

这个问题其实不用苦恼，主要原因是你用的GAPDH抗体除了识别34KD的目标抗体外，还非特异结合55KD的某蛋白，在结果处理时可无视它。如果非要解决这个问题，基本上要换这个内参抗体了。

kjeldahl

呵呵  是不是普通的抗体没用单抗，，呵呵呵只要出来就行了。。

mayansen1314

1 会不会是你转膜过程中出现电压不稳，导致蛋白弥散？
# J0 t6 R0 N: T1 d8 k9 b2 你用的抗体是多抗还是单抗，是多抗的话就不足为怪了。
" g5 I& o: E& v1 [5 s3 请楼主再仔细看一下，你一张膜是不是剪开加了两种抗体，最后曝光出来在一张胶片上，那样的话出现两条就正常了

龙之吻

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3 v6 ]* X  C' d; ^1 a) K' U- u# g0 H$ r
先谢谢你的回答。同实验室的做其他肿瘤细胞是一条带。关键是我用同样的样品做别的抗体也是两条带，而且所有显得都是一个位置，而且用的是单抗，所以觉得奇怪呢？

龙之吻

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4 M$ k, Y# ?  J$ t. m9 t2 J( L额，是单抗是单抗

龙之吻

回复 mayansen1314 的帖子( d) P3 F* O5 X& i' ?

7 J% L6 M7 N5 R- v先谢谢哈，前两种情况我已经看过了，没有那种情况。第三种我是分开加的抗体，压片是在一个暗盒里。不过所有杂交的抗体都是在一个位置出现条带，所以百思不得其解。觉得是不是样品二硫键没完全打开呢？

龙之吻

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2 m& l6 b8 l7 J$ t" i1 m! `第三种情况也不是，我一个膜显一种抗体出现两条带，即55KD\34KD。不同次做的不同抗体也是同样的位置出现两条带，重合性很高。关键抗体是单抗，且分子量是不同的。

张也行

你去Santa什么做抗体比较好的公司的网站上去查一查，看看他们做的WB得到的结果是什么样子的，说不定正常就是应该有两条带呢。

chb611301

我觉得你是不是应该提高一下封闭液的浓度，用>5%的脱脂牛奶去封闭，封闭时间再长一些，我觉得不是抗体的问题，显影出来的两条带深浅程度如何，都一样深吗我觉得不是抗体的问题，显影出来的两条带深浅程度如何，都一样深吗？