最近一个师妹的rt-PCR总有杂带

Learner

最近一个师妹的rt-PCR总有杂带不是实时定量PCR，欢迎分子生物学方面的同学参与讨论。是PCR试剂有污染，还是引物不好，引物是从一些文献中引用的不是自己设计的。还是PCR的程序选的不够好，还是因为反应循环太多，她用35-45个循环。提RNA使用的都是RNA酶free的枪头，PCR使用的是一般灭菌的枪头。

chleiwu

循环数30足以，另外有可能是cDNA中有DNA污染，提取的RNA可用DNA消化，枪头无大碍，可提高引物退火温度降低非特异性跳到，建议将成像图贴出来，可更直接分析。

chliu

建议首先摸索一下PCR反应条件，用不同的Mg离子浓度和不同的退火温度试一下，如果不行便考虑是不是有DNA污染或者引物不合适

Learner

回复 zgzjhzxyj 的帖子. w  M, g9 S7 n) p
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非常感谢！

zgzjhzxyj

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GAPDH和actin是很成熟的，应该不是引物的问题，提高点退火温度试试。! T: Y. Z! m% P/ a- E  v
引物设计原则见附件

Learner

谢谢大家的回复，我们会一一总结希望能找到原因！

Learner

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谢谢！我师妹用的有GAPDH和actin 内参也有杂带。关于引物设计有相关的书推荐一下吗？多谢了。

rain2402

PCR一般40个循环足够了，多了基本也是浪费时间。在提取RNA的时候应该加入DNase，而且文献上的引物绝大多数都不太可信，而且自己设计的时候要保证引物有特异性，要不会出现假阳性。

zgzjhzxyj

回复 Learner 的帖子4 I5 S" W  `; Y) I, H2 d9 Y* s
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在试剂没问题的前提下，提高1-2度退火温度，如果还有杂带，要考虑重新设计引物了。文献上的引物不一定好用，尤其是国内文献。你做的是什么指标，我最近有好些指标要设计，可以顺带帮你设计下看看。

lh_kitty

RNA 提取的质量建议用仪器检测一下（我们实验室用的是Nanodrop）或者跑胶看一下，如果不是RNA质量问题的话，应该考虑引物或者退火温度的因素，我最近也在做RT-PCR，在文献上找的引物，电泳结果不是很好。可以先设一个温度梯度，摸一次退火温度，如果还有杂带，可能要考虑重新寻找或者设计引物了