最近一个师妹的rt-PCR总有杂带

Learner

最近一个师妹的rt-PCR总有杂带不是实时定量PCR，欢迎分子生物学方面的同学参与讨论。是PCR试剂有污染，还是引物不好，引物是从一些文献中引用的不是自己设计的。还是PCR的程序选的不够好，还是因为反应循环太多，她用35-45个循环。提RNA使用的都是RNA酶free的枪头，PCR使用的是一般灭菌的枪头。

星移龙一

假阳性吧   提高下退火温度试试。

yuanyan2010

提取RNA的时候有没有做消化DNA的步骤，有可能是基因组DNA污染；还有就是楼上说的退货温度，可以做下子温度梯度，看下子哪个温度的较好。

lisaruirui

有时别人文献中的引物并不一定适合自己，现在都有软件可以自己设计引物再看看。这是在以上楼上说的实验步骤改善之后若还不行情况下 就再设计看看

lh_kitty

RNA 提取的质量建议用仪器检测一下（我们实验室用的是Nanodrop）或者跑胶看一下，如果不是RNA质量问题的话，应该考虑引物或者退火温度的因素，我最近也在做RT-PCR，在文献上找的引物，电泳结果不是很好。可以先设一个温度梯度，摸一次退火温度，如果还有杂带，可能要考虑重新寻找或者设计引物了

zgzjhzxyj

回复 Learner 的帖子# k4 u, I% x! i- h
( m1 g  R2 G& k+ O+ H/ N
在试剂没问题的前提下，提高1-2度退火温度，如果还有杂带，要考虑重新设计引物了。文献上的引物不一定好用，尤其是国内文献。你做的是什么指标，我最近有好些指标要设计，可以顺带帮你设计下看看。

rain2402

PCR一般40个循环足够了，多了基本也是浪费时间。在提取RNA的时候应该加入DNase，而且文献上的引物绝大多数都不太可信，而且自己设计的时候要保证引物有特异性，要不会出现假阳性。

Learner

回复 zgzjhzxyj 的帖子; }: b% I6 _$ l/ D) H

5 ~: C9 [2 |- x; a谢谢！我师妹用的有GAPDH和actin 内参也有杂带。关于引物设计有相关的书推荐一下吗？多谢了。

Learner

谢谢大家的回复，我们会一一总结希望能找到原因！

zgzjhzxyj

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- U1 e" \# g. q# X1 }# I; \$ m" l, F$ r
GAPDH和actin是很成熟的，应该不是引物的问题，提高点退火温度试试。
$ I3 b2 g# p# h8 Y$ T3 p引物设计原则见附件