miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。& Q- B' h2 d  q- }4 U
我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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, E1 p; |% a) m- ~1 Q6 Q

: V3 g; p% H& z; y大家看能不能参照这个
9 G4 k! m* r: Z7 {! @/ ysiRNA 的转染（24 孔板为例）
- U0 Z* U- U3 X8 d7 r/ z! [6 _I．准备细胞：
4 F8 t9 f0 I9 B1 G# C7 O贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  9 U& c; e  T+ Y% @5 f' {
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 ( o. h7 L2 C, T, K9 ]5 }

- s/ Y4 b/ }: r0 w9 }II．对于每个转染样品，按下面的方法准备： & f! W! \" t% ^& g
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
- g; C2 Z: O# [" i6 ]# r  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 " [+ L' Y# E. R) U
  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  6 i7 R3 p% u: {: f4 V9 ^" e1 s
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  
# v$ `( m, |1 q3 l$ n7 W  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。+ M( o+ N$ e) o! i) _" ]* x
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
: m: O: [' _0 U0 m1 F4 r, v4 RB. siRNA-RFect混合物准备：
. R8 {2 C( A6 O. f4 j1 h8 P7 S! t1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。5 N& z* l+ n' F; |, T
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
) w# B$ D- R) o" |- x( z  e3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。7 L1 N& ?. K2 d, n  k% N1 s
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
  B- B3 H0 s% e! s2 D3 }: x1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。; s/ I% L3 Y: R1 x) Q9 P
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、- P- \) a' W) L
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了