miRNA模拟物的转染体系与步骤

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希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
) _  l4 ]( }8 ], o, z# [+ N% c我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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) }4 X; C2 n* U+ M7 T1 l/ \, G8 k7 G% S1 u( Y
大家看能不能参照这个, P* K: l0 s8 h  M. \/ {9 R
siRNA 的转染（24 孔板为例）
/ b6 S3 k, \( d/ W* TI．准备细胞：
+ O( p+ O9 j0 Y' ^& M贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  
* a3 h$ q# E. _# X/ n& a+ O/ a/ q0 ]  e悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。
. v; _" N6 }7 A( \" C " P6 s, k# b0 c
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
8 R5 \  Q/ y$ i6 b  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
. J: N8 X# q( N% [+ b% M: X  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。
' a- h0 o. C" z9 J! l% k$ t+ h/ x1 Q  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  
' r! O& o7 r0 U+ R1 J  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  
5 c. j1 J/ U; U! ~; q  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。: J) d! e1 J5 E  F4 o6 D6 Z
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
2 n" e1 d) d# F+ c9 WB. siRNA-RFect混合物准备：
  K0 [9 m3 D2 q! H4 t. {2 o8 F. a3 f% T1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。: e5 \4 J- K$ C1 P! [7 ~# a
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
/ W  s  s0 z# x, y& V3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。  _/ Q" K% C! u: M
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
: `9 r/ \* p2 \3 A7 }( W1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。! A4 D. O& z% m& j/ Q- I
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
; V& m1 y' e8 q; H' Q( C: @所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了